ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ୟୁନିଭରସିଟି ସ୍କୁଲ୍ ଅଫ୍ ମେଡିସିନ୍, ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ୟୁନିଭରସିଟି, କାଲିଫର୍ନିଆର ପିଟର ସାରନୋଙ୍କ ଦ୍ୱାରା ସମ୍ପାଦିତ, ଡିସେମ୍ବର 25, 2020 ରେ ଅନୁମୋଦିତ ହୋଇଥିଲା (ଅକ୍ଟୋବର 25, 2020 ରେ ସମୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା)
ଆମେ କରୋନାଭାଇରସ୍-ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ନକଲରେ ସବନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କକୁ ରିପୋର୍ଟ କରୁ, ଯାହା ନକଲ ଏବଂ ବିବର୍ତ୍ତନ ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ ଜରୁରୀ |ଆମେ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରିଛୁ ଯେ nsp12 ସହିତ ଜଡିତ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ଟ୍ରାନ୍ସରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ (NMP) ସ୍ଥାନାନ୍ତର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି ଏବଂ nsp9 (ଏକ RNA ବାଇଣ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍) କୁ ଏହାର ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରିଛି |NiRAN ଏକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ସଂରକ୍ଷିତ nsp9 ଆମିନୋ ଟର୍ମିନାସରେ NMP ମୋୟାଟିର କୋଭାଲାଣ୍ଟ ସଂଲଗ୍ନକୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରେ ଯାହା Mn2 + ଆୟନ ଏବଂ ସଂଲଗ୍ନ ସଂରକ୍ଷିତ ଆସନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ |ଏହା ଦେଖାଗଲା ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ନକଲ ପାଇଁ NiRAN କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ nsp9 NMPylation ଜରୁରୀ |ତଥ୍ୟ ଆମକୁ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ଏନଜାଇମ୍ ମାର୍କର ଏହି କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ହାଇପୋଥେସିସରେ ପୂର୍ବ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ସହିତ ଯୋଡିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ ଯେ RNA ଜୀବାଣୁର ଏକ ଶ୍ରେଣୀରେ RNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଏବଂ ବିବର୍ତ୍ତନଗତ ଭାବରେ ସ୍ଥିର ଅଟେ |
ନିଡୋଭିରାଲେସ୍ (କରୋନାଭିରିଡା, ଆର୍ଟେରୋଭାଇରିଡା, ଏବଂ ଅନ୍ୟ 12 ପରିବାର) ର RNA- ନିର୍ଭରଶୀଳ RNA ପଲିମେରେଜ୍ (RdRps), ନିଆରାନ୍ ନାମକ ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ ରୁ ନିର୍ଗତ ଅଣ-ଗଠନମୂଳକ ପ୍ରୋଟିନ୍ (nsp) ଡୋମେନ୍ ସହିତ ଆମିନୋ ଟର୍ମିନାଲ୍ (N- ଟର୍ମିନାଲ୍) ଡୋମେନ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ | 1ab ଭାଇରାଲ୍ ମେନ୍ ପ୍ରୋଟିସ୍ (Mpro) କୁ ନେଇ ଗଠିତ |ପୂର୍ବରୁ, ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ NiRAN-RdRp nsp ର ନିଜସ୍ୱ GMPylation / UMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ମନୋଫୋସଫେଟ୍ (NMP) କୁ (ବର୍ତ୍ତମାନ ଅଜ୍ଞାତ) ଜୀବାଣୁ ଏବଂ / କିମ୍ବା ସେଲ୍ ବାୟୋପଲିମେରାଇଜେସନ୍ ଜିନିଷକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ପାଇଁ ଏକ କ୍ଷଣସ୍ଥାୟୀ ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ ପରାମର୍ଶ ଦିଆଯାଇଥିଲା |ଏଠାରେ, ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ (ହ୍ୟୁମାନ୍ କରୋନାଭାଇରସ୍ [HCoV] -229E ଏବଂ ଗୁରୁତର ତୀବ୍ର ଶ୍ ir ାସକ୍ରିୟା ସିଣ୍ଡ୍ରୋମ୍ କରୋନାଭାଇରସ୍ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ରେ Mn2 + ନିର୍ଭରଶୀଳ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି, ଯାହାକି Mpro- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 ଗଠନ ପରେ nsp9 ରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ | N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଫ୍ଲାଙ୍କିଙ୍ଗ୍ nsps ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ଭାବରେ ମୁକ୍ତ ହୋଇଛି, ଫସଫୋରାମିଡେଟ୍ nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାଲରେ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ (N3825) ସହିତ ବନ୍ଧା |ଏହି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ୟୁରିଡାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ ହେଉଛି ପସନ୍ଦିତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍, କିନ୍ତୁ ଆଡେନୋସାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍, ଗୁଆନୋସିନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ ଏବଂ ସାଇଟିଡାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ ମଧ୍ୟ ଉପଯୁକ୍ତ ସହ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଅଟେ |ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ କରୋନାଭାଇରସ୍ nsp9 ଏବଂ nsp12 ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଜେନେଟିକ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ HCoV-229E ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଅଧ୍ୟୟନ NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 NMPylation ଏବଂ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ଜୀବାଣୁ ନକଲ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କଲା |ତଥ୍ୟ NiRAN ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକର ଭବିଷ୍ୟବାଣୀକୁ ନିଶ୍ଚିତ କଲା ଏବଂ nsp9 NMPylation ରେ nsp9 N3826 ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋରେ ଜୀବାଣୁ ନକଲରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କଲା |ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ସଂରକ୍ଷିତ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ NNE ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ଏକ ଅଂଶ ଏବଂ nsp9 ର ଏକମାତ୍ର ଅବ arian ଧ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାରରେ ଏହାର ହୋମୋଲୋଜ୍ ବୋଲି ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ ଅନ୍ୟ ବସା ବାନ୍ଧୁଥିବା NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ଏକ ଦୃ solid ମୂଳଦୁଆ ଯୋଗାଇଥାଏ ଏବଂ ଆଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ drugs ଷଧର ବିକାଶ ପାଇଁ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ପ୍ରସ୍ତାବ ଦେଇଥାଏ |
ନିଡୋଭାଇରଲେସ୍ ପଜିଟିଭ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡେଡ୍ RNA ଜୀବାଣୁ ବିଭିନ୍ନ ମେରୁଦଣ୍ଡୀ ଏବଂ ମେରୁଦଣ୍ଡୀ ଜୀବ (1, 2) କୁ ସଂକ୍ରମିତ କରନ୍ତି |ଏହି କ୍ରମରେ ବର୍ତ୍ତମାନ 14 ପରିବାର (3) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯେଉଁମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ ଗତ 20 ବର୍ଷ ମଧ୍ୟରେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାର ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଛି |ସେହି ସମୟରେ, ପ୍ରାଣୀ ହୋଷ୍ଟରୁ ତିନୋଟି ଜୁନୋଟିକ୍ କରୋନାଭାଇରସ୍ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ମାନବରେ ଭୟଙ୍କର ଶ୍ ir ାସକ୍ରିୟା ସଂକ୍ରମଣର ବ୍ୟାପକ ଆକାରରେ ଆକ୍ରାନ୍ତ ହୋଇଥିଲା |ଗୁରୁତର ତୀବ୍ର ସଂକ୍ରାମକ ରୋଗ ଦ୍ caused ାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା କ୍ରମାଗତ ମହାମାରୀକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି |ଶ୍ ir ାସକ୍ରିୟା ସିଣ୍ଡ୍ରୋମ କରୋନାଭାଇରସ୍ ୨ (SARS-CoV-2) (4âââ7) |ନିଡୋଭାଇରସ୍ ଏକ ସାଧାରଣ ଜିନୋମ୍ ସଂଗଠନ ଅଂଶୀଦାର କରନ୍ତି, ଏବଂ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍-ବନ୍ଧା ନକଲ-ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ (RTC) ର ସବନିଟ୍ 5-? ² ଟର୍ମିନାଲ୍ ଦୁଇ-ତୃତୀୟାଂଶ ଏବଂ ଜୀବାଣୁ କଣିକାର ମୁଖ୍ୟ ଗଠନମୂଳକ ସବନିଟ୍, ଏବଂ କିଛି ଆନୁଷଙ୍ଗିକରେ ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଛି | ।ପ୍ରୋଟିନ୍, ଜିନୋମର 3 ?? ² ଶେଷ ତୃତୀୟରେ ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଛି |ପ୍ଲାନାରିଆନ୍ ଭାଇରସ୍ (ମୋନୋଭିରିଡା) (8) ର ଗୋଟିଏ ପରିବାରକୁ ଛାଡିଦେଲେ, ସମସ୍ତ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ଦୁଇଟି ବଡ଼ ଖୋଲା ପଠନ ଫ୍ରେମ୍ (ORF) ORF1a ଏବଂ ORF1b ରେ RTC ସବନିଟ୍ ଏନକୋଡ୍ କରନ୍ତି, ଯାହା ଜେନୋମିକ୍ RNA ରୁ ଅନୁବାଦ କରାଯାଇଥାଏ |ORF1a ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ (pp) 1a, ଏବଂ ORF1a ଏବଂ ORF1b ମିଳିତ ଭାବରେ pp1ab କୁ ଏନକୋଡ୍ କରେ |ORF1a ଦ୍ enc ାରା ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଥିବା ମୁଖ୍ୟ ପ୍ରୋଟିସ୍ (Mpro) ର ସାଧାରଣ ଅଂଶଗ୍ରହଣ ସହିତ, ଉଭୟ pp1a ଏବଂ pp1ab ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର ଅଣ-ଗଠନମୂଳକ ପ୍ରୋଟିନ୍ (nsps) ରେ ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ହୁଏ, ଯାହା 3CLpro ଭାବରେ ମଧ୍ୟ ଜଣାଶୁଣା, କାରଣ ଏଥିରେ ପିକୋରନାଭାଇରସ୍ ର 3Cpro ସହିତ ହୋମୋଲୋଜି ଅଛି | 9)ଏହି nsps ଗୁଡିକ ଏକ ବୃହତ ଗତିଶୀଳ RTC ରେ ଏକତ୍ରିତ ହେବା, ଜେନୋମିକ୍ RNA (ନକଲ) ଏବଂ ସବ୍ଜେନୋମିକ୍ RNA (ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍) ର ଏକ ସିନ୍ଥେସିସ୍ କାଟାଲାଇଜ୍ କରାଯାଏ, ଏବଂ ORF1b (10) ର ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ରେ ଅବସ୍ଥିତ ORF ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିକୁ ସମନ୍ୱୟ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ କି? ? 12)
ମୂଳ ଆରଟିସିରେ RNA- ନିର୍ଭରଶୀଳ RNA ପଲିମେରେଜ୍ (RdRp) (13), ସୁପରଫ୍ୟାମିଲି 1 ହେଲିକେଜ୍ (HEL1) (14, 15) ଏବଂ ଅନେକ RNA ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଏନଜାଇମ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯାହା ମୁଖ୍ୟତ OR ORF1b ରେ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାରରେ ଏଥିରେ nsp12-nsp16 ଏବଂ ଧାରଣ କରିଥାଏ | ଆର୍ଟେରିଓଭାଇରିଡା ପରିବାରରେ nsp9-nsp12 (ରେଫରେନ୍ସ 10ââ 12 ଦେଖନ୍ତୁ) |RdRp ଏବଂ HEL1 ପକ୍ଷୀର ବସା ଜୀବାଣୁର ଦୁଇଟି (ଏକ-ପଞ୍ଚମାଂଶ) ସଂରକ୍ଷିତ ଡୋମେନ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି ଏବଂ ଅନ୍ୟ RNA ଜୀବାଣୁ ମଧ୍ୟରେ ହୋମୋଲୋଜି ଥାଏ |କୋର ପ୍ରତିକୃତି ଅନ୍ୟ ସବନିଟ୍ ଦ୍ୱାରା ସାହାଯ୍ୟ ହେବ ବୋଲି ବିଶ୍ believed ାସ କରାଯାଏ, pp1a ର କାର୍ବକ୍ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ (ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍) ଅଞ୍ଚଳରୁ ମୁକ୍ତ ହୋଇଥିବା ଅନେକ ଛୋଟ nsps, ଯଥାକ୍ରମେ Mpro ର ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ (କରୋନାଭାଇରସ୍ nsp5 ଏବଂ ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ nsp4) |ସେମାନଙ୍କର ସୀମିତ ପରିବାର-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସୁରକ୍ଷା ଏବଂ ବିବିଧ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି (ରେଫରେନ୍ସ 10ââ12 ରେ ସମୀକ୍ଷା କରାଯାଇଛି) |
ଆପେକ୍ଷିକ ଭାବରେ, ଅନନ୍ୟ କ୍ରମର ମୋଟିଫ୍ ବ characteristics ଶିଷ୍ଟ୍ୟ ବିଶିଷ୍ଟ ଏକ ଡୋମେନ୍ ସମସ୍ତ ବସା ଯାଇଥିବା ଜୀବାଣୁରେ RdRp ନିକଟରେ ଥିବା ଆମିନୋ ଟର୍ମିନାସ୍ (N- ଟର୍ମିନାସ୍) ରେ ମିଳିଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଅନ୍ୟ କ R ଣସି RNA ଜୀବାଣୁ (16) |ଏହାର ଅବସ୍ଥାନ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫରେଜ୍ (ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ [NMP] ଟ୍ରାନ୍ସଫରେଜ୍) କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ ଆଧାର କରି ଏହି ଡୋମେନ୍ ର ନାମ ହେଉଛି NiRAN (ନେଷ୍ଟଭାଇରସ୍ RdRp- ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫରେଜ୍) |NiRAN-RdRp ର ଡୁଆଲ୍-ଡୋମେନ୍ ମିଶ୍ରଣ କରୋନାଭିରିଡା ପରିବାରରେ nsp12 ଏବଂ ଆର୍ଟେରୋଭାଇରିଡା ପରିବାରରେ nsp9 ଏବଂ ଅନ୍ୟ ନେଷ୍ଟୋଭାଇରିଡାଠାରେ NiRAN-RdRp ଭାଇରାଲ୍ ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ ଠାରୁ ଏକ ସ୍ independent ାଧୀନ nsp ଭାବରେ ମୁକ୍ତ ହେବ ବୋଲି ଆଶା କରାଯାଏ |କରୋନାଭାଇରସରେ, NiRAN ଡୋମେନ୍ ?? 1/450 ଅବଶିଷ୍ଟ ଧାରଣ କରିଥାଏ ଏବଂ ଲିଙ୍କର୍ ଅଞ୍ଚଳ (16? 19) ମାଧ୍ୟମରେ C- ଟର୍ମିନାଲ୍ RdRp ଡୋମେନ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ |ଇକ୍ୱାଇନ୍ ଆର୍ଟେରାଇଟିସ୍ ଭାଇରସ୍ (EAV) (Arteriviridae) ରେ, ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ nsp9 Mn2 + ଆୟନ-ନିର୍ଭରଶୀଳ (ଆତ୍ମ) UMPylation ଏବଂ GMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଦର୍ଶାଏ, ଯାହା ନେଷ୍ଟୋଭାଇରସ୍, AN, BN ଏବଂ CN ର ତିନୋଟି ସଂରକ୍ଷିତ କ୍ରମ ଆଧାର ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ |ଯେଉଁଠାରେ N NiRAN ପାଇଁ ଛିଡା ହୋଇଛି) (16) |ଏହି ମୋଟିଫ୍ ର N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଫ୍ଲାଙ୍କିଙ୍ଗ୍ ଏକ କମ୍ ରକ୍ଷଣଶୀଳ ମୋଟିଫ୍ preAN |ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରୁ କେତେକ ଦୂର ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସରେ ମଧ୍ୟ ସଂରକ୍ଷିତ, ଯେଉଁଠାରେ ସେମାନେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓସାଇଡ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ (NTP) ବନ୍ଧନ ଏବଂ କାଟାଲାଇଟିସ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ଜଡିତ ଥିବା ଦେଖାଯାଇଛି |ଏହି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ସହିତ ସ୍ଥିର, ସିଉଡୋମାନାସ୍ ସିରିଞ୍ଜାରୁ ସିଉଡୋକିନାସେ ସେଲୋରେ ଅନେକ ପ୍ରମୁଖ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକ ନିକଟରେ ପ୍ରକାଶିତ SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 ସୁପରକମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ସହିତ ଏକତ୍ର ହୋଇପାରିବ |ସଂରକ୍ଷିତ କରୋନାଭାଇରସ୍ ନିଆରନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ ଇଲେକ୍ଟ୍ରନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍ଟ୍ରଷ୍ଟ୍ରକଚରରେ ସୁପରମିଡ୍ |ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (୧)) |ଏହା ଅନୁମାନ କରାଯାଏ ଯେ ଡକ୍ୟୁମେଣ୍ଟ୍ ହୋଇଥିବା (ସ୍) ୟଂ) U / GMPylation NMP କୁ (ବର୍ତ୍ତମାନ ଅଜ୍ଞାତ) ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ (16) କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିବା ପାଇଁ ଏକ କ୍ଷଣସ୍ଥାୟୀ ଅବସ୍ଥା ସୃଷ୍ଟି କରିବ ଏବଂ NiRAN ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସେ (17, 19) ମଧ୍ୟରେ ଗଠନମୂଳକ ସମାନତା ହେଉଛି ଅନୁମାନ ଯାହା କି? NiRAN ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଶୋଧନ କରେ |
ଅନେକ ବ features ଶିଷ୍ଟ୍ୟ, ଏହାର ଅନନ୍ୟ ଏବଂ ଅନନ୍ୟ ବ୍ୟବସ୍ଥିତ ଆସୋସିଏସନ୍ ସହିତ ନଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ଏବଂ RdRp ରୁ ଜେନେଟିକ୍ ପୃଥକତା, NiRAN କୁ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ପାଇଁ ଏକ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ କି ନିୟାମକ ଏନଜାଇମ୍ କରିଥାଏ, ଯାହା ସେମାନଙ୍କର ଉତ୍ପତ୍ତି ଏବଂ ପରିଚୟ ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ |ପୂର୍ବରୁ, ଜିନୋମ / ସବଜେନୋମିକ୍ ଅନୁବାଦ କିମ୍ବା ନକଲ / ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବା ପାଇଁ NiRAN ସହିତ ଜଡିତ ତିନୋଟି ସମ୍ଭାବ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟ କୁହାଯାଉଥିଲା |ସେହି ସମୟରେ ଉପଲବ୍ଧ ଅଭାବ ଏବଂ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ତଥ୍ୟକୁ ବିଚାର କରିବାବେଳେ, ପ୍ରତ୍ୟେକ କାର୍ଯ୍ୟର ଏହାର ସୁବିଧା ଏବଂ ଅସୁବିଧା ଅଛି (16) |ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନରେ, ଆମେ ଦୁଇଟି ଜେନେରାର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରୁଥିବା କରୋନାଭାଇରସ୍ ର ବାୟୋକେମିକାଲ୍ ଏବଂ ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ ଅଧ୍ୟୟନକୁ ଏକତ୍ର କରିବାକୁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ରଖିଛୁ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାରର ପ୍ରାକୃତିକ ପରିବର୍ତ୍ତନର ବିବର୍ତ୍ତନ ପୃଷ୍ଠଭୂମିରେ ଆମର ଅନୁସନ୍ଧାନଗୁଡିକୁ ରଖିବା, ଯାହା ଦ୍ this ାରା ଏହି ରହସ୍ୟମୟ କ୍ଷେତ୍ର ବିଷୟରେ ଜ୍ଞାନ ହାସଲ କରିବା |ଆମେ RTC ରେ ପ୍ରାକୃତିକ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକର ଚିହ୍ନଟ ମାଧ୍ୟମରେ NiRAN ର ବୁ understanding ାମଣାରେ ପ୍ରମୁଖ ଅଗ୍ରଗତି ବିଷୟରେ ରିପୋର୍ଟ କରୁ, ଯାହା (ଉପଲବ୍ଧ ତିନୋଟି ଅନୁମାନ ମଧ୍ୟରେ) ନାଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ RNA ର ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭ କରିବାରେ ଏହି ଡୋମେନ୍ ର ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ |ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନ ଭାଇରସ୍ ହୋଷ୍ଟ ଇଣ୍ଟରଫେସରେ NiRAN ର ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଭୂମିକା ପାଇଁ ସମ୍ଭାବନା ମଧ୍ୟ ଖୋଲିଥାଏ |
କରୋନା ଭାଇରସ୍ nsp12- ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ଗୁଣକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଇ-କୋଲିରେ ମାନବ କରୋନାଭାଇରସ୍ 229E (HCoV-229E) nsp12 ର ଏକ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଫର୍ମ ଉତ୍ପାଦନ କଲୁ, ଏବଂ ସି-ଟର୍ମିନାସରେ His6 ଟ୍ୟାଗ୍ ସହିତ, ଏବଂ ମିଳିତ କଲୁ | [α32-P] ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ MnCl2 ର ଉପସ୍ଥିତିରେ NTP ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ ଯେପରି ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦର ବିଶ୍ଳେଷଣରେ nsp12 (106 kDa) ସହିତ ସହ-ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କରୁଥିବା ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ଉପସ୍ଥିତି ସୂଚାଇଥାଏ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ nsp12 କୋଭାଲାଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍- NMP ଆଡକ୍ଟସ୍ ଗଠନକୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରିଥାଏ, ବିଶେଷତ ur ୟୁରିଡାଇନ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ (UMP) (ଚିତ୍ର 1A) ଏବଂ ଖ) |ପରିମାଣିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅନ୍ୟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ତୁଳନାରେ, UMP ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତିର ସଙ୍କେତ ତୀବ୍ରତା 2 ରୁ 3 ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 1C) |ଏହି ତଥ୍ୟ କରୋନାଭାଇରସ୍ (16) ର NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ପୂର୍ବାନୁମାନିତ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ସମାନ, କିନ୍ତୁ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ପସନ୍ଦ ଏବଂ ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ ଭିନ୍ନ |
HCoV-229E nsp12 ର ସ୍ୱୟଂ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ |(କ) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 6 mM MnCl2 ଉପସ୍ଥିତିରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ [α-32P] NTP ସହିତ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା (ବିବରଣୀ ପାଇଁ ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି ଦେଖନ୍ତୁ) |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ଅଲଗା ହୋଇ କୁମାସି ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ନୀଳ ରଙ୍ଗରେ ଦାଗଯୁକ୍ତ |(ଖ) ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଫସଫରସ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ଦ୍ୱାରା ଭିଜୁଆଲ୍ ହୋଇଥାଏ |Nsp12-His6 ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଲିକୁଲାର୍ ମାସ୍ ମାର୍କର୍ସ (କିଲୋଡାଲ୍ଟନରେ) A ଏବଂ B ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି (C) ରେଡିଓଆକ୍ଟିଭ୍ ସିଗ୍ନାଲ୍ (ଅର୍ଥାତ୍ ± SEM) ର ତୀବ୍ରତା ତିନୋଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |* P≤0.05ସଙ୍କେତ ଶକ୍ତି (ଶତକଡା) UTP ସହିତ ଜଡିତ |
ଯଦିଓ ସେଲ୍ ସଂସ୍କୃତିରେ EAV ଏବଂ SARS-CoV ର ନକଲ ପାଇଁ NiRAN ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଜରୁରୀ ବୋଲି ଦର୍ଶାଯାଇଛି, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NiRAN କାର୍ଯ୍ୟ ଏବଂ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇ ନାହିଁ |NiRAN ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିବାର ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସ୍ ପରି ଫୋଲ୍ଡସ୍ (17, 22) ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପ୍ରତି ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା ଗଠନମୂଳକ ସମାନତା ଆମକୁ ଅନୁମାନ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ କହିଲା ଯେ NiRAN ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର NMPylation କୁ ଅନୁକରଣ କରିଥାଏ |ଆମେ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ଦ୍ୱାରା ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଥିବା ଅଣ-ଗଠନମୂଳକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ହୋମୋଲୋଜି ଲକ୍ଷ୍ୟର ଏକ ସେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ, ପ୍ରତ୍ୟେକରେ ଏକ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ His6 ଟ୍ୟାଗ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ସାରଣୀ S1), ଏବଂ nsp12 ର ଉପସ୍ଥିତିରେ କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ଏହି ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ [α32-P] ୟୁରିଡାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ ([α32-P] UTP) ସହିତ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରନ୍ତୁ |ଇ କୋଲିରେ ଉତ୍ପାଦିତ ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ ଆଲବମିନ ଏବଂ MBP-LacZα ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କଲା (ଚିତ୍ର 2 ଏ, ଗାଡ଼ି 1 ରୁ 7) |ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସୋଡିୟମ୍ ଡୋଡେସିଲ୍ ସଲଫେଟ୍-ପଲିୟାକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଜେଲ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ (SDS-PAGE) ଏବଂ ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫି ଦ୍ analy ାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ nsp12 ଏବଂ nsp9 ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ରେଡିଓଆକ୍ଟିଭ୍ ସଙ୍କେତ ଥିବା ଜଣାପଡିଛି |ସଙ୍କେତର ସ୍ଥିତି nsp9 ର ମଲିକୁଲାର ମାସ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ, nsp9 ର ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylation କୁ ସୂଚାଇଥାଏ (ଚିତ୍ର 2 ବି, ଟ୍ରାକ୍ 7) |ଅନ୍ୟ କ test ଣସି ପରୀକ୍ଷଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ UMPylated ବୋଲି ମିଳିଲା ନାହିଁ, ଯାହା ଆମକୁ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେବାକୁ ଲାଗିଲା ଯେ nsp9 ହେଉଛି nsp12 ର ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ |ଚିତ୍ର 1 ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଆତ୍ମ- NMPylation ତଥ୍ୟ ସହିତ ସ୍ଥିର, nsp12 ସମସ୍ତ ଚାରୋଟି NMP କୁ nsp9 କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିବାରେ ସକ୍ଷମ, ଯଦିଓ ଦକ୍ଷତା ଭିନ୍ନ, UMP> ଆଡେନୋସାଇନ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ (AMP)> ଗୁଆନୋସିନ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ (GMP)> ସାଇଟିଡାଇନ୍ ମୋନୋଫୋସଫେଟ୍ (CMP)) ଚିତ୍ର)3 A ଏବଂ B)ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନରେ ବ୍ୟବହୃତ ଅବସ୍ଥାରେ (ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଏବଂ ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟକୁ ଛୋଟ କର, nsp12 ର ଏକାଗ୍ରତା ହ୍ରାସ କର; ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି), nsp12 ର ସ୍ N ୟଂ NMPylation ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରିଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 2 ବି, ଗାଡ଼ି 7, ଏବଂ ଚିତ୍ର 1 ବି ତୁଳନା କର), ଯାହା ଏକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ପ୍ରମାଣିତ ହେଲା (ଏବଂ ଏକାଧିକ ରାଉଣ୍ଡ) UMP nsp12 ରୁ nsp9 କୁ ଚାଲିଗଲା |ଚିତ୍ର 3C ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି UMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ Mn2 + ଆୟନର ଉପସ୍ଥିତି ଆବଶ୍ୟକ କରେ, ଯେତେବେଳେ Mg2 + ର ଉପସ୍ଥିତିରେ କେବଳ ସର୍ବନିମ୍ନ UMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ଏବଂ ପରୀକ୍ଷିତ ଅନ୍ୟ ଦୁଇଟି ସମାନ୍ତରାଳ କାଟେସନର ଉପସ୍ଥିତିରେ କ activity ଣସି କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନଥିଲା |ସାଇଟାଇଡାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ (CTP), ଗୁଆନୋସିନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ (ଜିଟିପି) ଏବଂ ଆଡେନୋସାଇନ୍ ଟ୍ରାଇଫୋସଫେଟ୍ (ଏଟିପି) (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S1) ଧାରଣ କରିଥିବା NMPylation ଅନୁଧ୍ୟାନରେ ସମାନ ତଥ୍ୟ ମିଳିଥିଲା |
HCoV-229E nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylation nsp9 |HCoV-229E nsp12-His6⁺- ମଧ୍ୟସ୍ଥର UMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ (ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ ଆଲବମିନ, MBP-lacZα ଏବଂ C- ଟର୍ମିନାଲ୍ His6 ସହିତ ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଥିବା HCoV-229E nsps ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା | ପ୍ରୋଟିନ୍ |ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି nsp12 ର ଅନୁପସ୍ଥିତି (A) କିମ୍ବା ଉପସ୍ଥିତି (B) ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ [α-32P] UTP ସହିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରନ୍ତୁ |A ଏବଂ B ର ଶୀର୍ଷରେ, କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ ବ୍ଲୁ ସହିତ ଦାଗଯୁକ୍ତ SDS-polyacrylamide gel ଦେଖାଯାଏ, ଏବଂ A ଏବଂ B ତଳେ, ସଂପୃକ୍ତ ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାମଗୁଡିକ ଦେଖାଯାଏ |ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଲିକୁଲାର୍ ମାସ୍ ମାର୍କର ସ୍ଥିତି (କିଲୋଡାଲ୍ଟନ୍ରେ) ବାମ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଦିଆଯାଇଛି |Nsp12-His6 (B, ଉପର) ଏବଂ nsp9-His6 (B, ଗାଡ଼ି 7) ସହିତ nsp12-His6 ର ଇନକ୍ୟୁବେସନ ସମୟରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ରେଡିଓଆକ୍ଟିଭ୍ ସିଗନାଲ୍ ମଧ୍ୟ ସୂଚିତ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ [α-32P] UMP ରୁ nsp9-His6 | (12.9 kDa), ଯାହା ପରୀକ୍ଷିତ ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ ପାଳନ କରାଯାଇନଥିଲା |
HCoV-229E NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ ବାୟୋକେମିକାଲ୍ ଏବଂ nsp9 NMPylation ର ଭାଇରୋଲୋଜିକାଲ୍ ଚରିତ୍ର |(ଏ ଏବଂ ବି) ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବ୍ୟବହୃତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କୋ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ର ଭୂମିକା |Nsp12-His6 ଏବଂ nsp9-His6 ମିଶ୍ରିତ ଏବଂ ମାନକ NMPylation ଆସେରେ ବିଭିନ୍ନ [α-32P] NTP ର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ |(A, ଶୀର୍ଷ) କୁମାସି-ଦାଗିତ nsp9-His6 SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ |(ଏ, ତଳ) ଜେଲର ସମାନ ଅଞ୍ଚଳର ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫ୍ |(ଖ) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କୋଫାକ୍ଟରର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଆପେକ୍ଷିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (ଅର୍ଥ ± SEM) ତିନୋଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଏ |* P≤0.05(ଗ) ଧାତୁ ଆୟନର ଭୂମିକା |[Α-32P] UTP ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ଧାତୁ ଆୟନର ଉପସ୍ଥିତିରେ ମାନକ NMPylation ପରୀକ୍ଷା ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି, ପ୍ରତ୍ୟେକରେ 1 ମିଟର ଏକାଗ୍ରତା ଅଛି |C ରେ, ଉପର, କୁମାସି ଦାଗଯୁକ୍ତ nsp9-His6 ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି, ଏବଂ C ରେ, ତଳେ, ସଂପୃକ୍ତ ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫି ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି |ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନର ଆକାର (କିଲୋଡାଲ୍ଟନରେ) A ଏବଂ C ର ବାମକୁ ଦେଖାଯାଏ (D) ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ବହନ କରୁଥିବା HCoV-229E nsp12-His6 ର ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଫର୍ମ [α-32P] UTP ରେ ଅଛି, ବର୍ଣ୍ଣନା ଅନୁଯାୟୀ | ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ |NMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଉତ୍ପାଦିତ ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ nsp9-His6 ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ (D, ଶୀର୍ଷ) ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ |ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ତୁଳନାତ୍ମକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ D ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି, ଏବଂ ତଳଟି ତିନୋଟି ସ୍ୱାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ହାରାହାରି (± SEM) ଭାବରେ ନିଆଯାଏ |ଆଷ୍ଟେରିସ୍କ ଅଣ-ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନକୁ ସୂଚିତ କରେ |(ଇ) ପ୍ଲେକ୍ ଆସେ ଦ୍ infection ାରା ସଂକ୍ରମଣର 24 ଘଣ୍ଟା ପରେ ପ୍ରାପ୍ତ p1 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସଂସ୍କୃତି ଅଲ ern କିକ ଜୀବାଣୁରେ ଥିବା ଜୀବାଣୁ ଟାଇଟର୍ |ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ HCoV-229E ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟର NiRAN ଡୋମେନ୍ ରେ ଥିବା କୋଡନ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରାଯାଇଛି (ଅବଶିଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟାକରଣ pp1ab ରେ ସେମାନଙ୍କ ସ୍ଥିତିକୁ ଆଧାର କରି) |ନକଲ-ଅଭାବ RdRp ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ nsp12_DD4823 / 4AA ଏକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |
NiRAN ର ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ବିଷୟରେ ଏକ ଗଭୀର ବୁ understanding ାମଣା ପାଇବାକୁ ଏବଂ nsp9- ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ଜଡିତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ, ଆମେ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଆନାଲିସିସ୍ କରିଥିଲୁ, ଯେଉଁଥିରେ ଆମେ NiRAN AN, BN ଏବଂ CN ମୋଟିଫ୍ ରେ ରକ୍ଷଣଶୀଳ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ ବଦଳାଇଥିଲୁ ( 16) ଏହା ଆଲା (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S2) |ଏଥିସହ, ଦୁଇଟି କ୍ଷେତ୍ରରେ ରକ୍ଷଣଶୀଳ Arg-to-Lys କିମ୍ବା Lys-to-Arg ପ୍ରତିସ୍ଥାପନର ପ୍ରଭାବକୁ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ (ନକାରାତ୍ମକ) ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ, ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଯାହା କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ର NiRAN ଡୋମେନ୍ରେ ସଂରକ୍ଷିତ ନୁହେଁ କିମ୍ବା ଆଲା ସହିତ K4116A (motif preAN ରେ), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif) କୁ ବଦଳାଯାଏ | BN) ଏବଂ D4280A (CN) nsp12 ମାଧ୍ୟମରେ nsp9 NMPylation କୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କରିଥାଏ କିମ୍ବା ବିଲୋପ କରିଥାଏ, ଯେତେବେଳେ କି ସଂରକ୍ଷଣକାରୀ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (R4178K), K4116R) ପ୍ରୋଟିନ୍ ସେମାନଙ୍କର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର 60% ଏବଂ 80% ରଖେ, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ନିଜ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଥିବା ପ୍ରତିବନ୍ଧକକୁ ଆରାମ ଦେଇଥାଏ | ଶୃଙ୍ଖଳା ଶାରୀରିକ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ (ଚିତ୍ର 3D) |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟ E4145A, D4273A, F4281A ଏବଂ D4283A କୁ ବଦଳାଇବା ବହୁତ କମ୍ କ୍ଷତିକାରକ, ଏବଂ nsp9 UMPylation କେବଳ ସାମାନ୍ୟ ହ୍ରାସ ପାଇଥାଏ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ NTP (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S3) ସହିତ ଜଡିତ nsp9 NMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ସମାନ ଫଳାଫଳ ମିଳିଥିଲା, ଏହା ନିଶ୍ଚିତ କରେ ଯେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଉପରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପ୍ରଭାବଗୁଡିକ ବ୍ୟବହୃତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ କୋ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ପ୍ରକାରଠାରୁ ସ୍ are ାଧୀନ ଅଟେ |ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର ନକଲ ଉପରେ ଏହି nsp12 ପ୍ରତିସ୍ଥାପନର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରଭାବ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ |ଏହି ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ, ଆମେ 5 -7 କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କରିବା ପାଇଁ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଟିକା ଟିକା (23, 24) ରେ କ୍ଲୋନ ହୋଇଥିବା ଉପଯୁକ୍ତ ଜେନେଟିକ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ DNA (cDNA) ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |ଏହି କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଉତ୍ପାଦିତ ସଂକ୍ରାମକ ଜୀବାଣୁ ବଂଶର ଟାଇଟ୍ରେସନ୍ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ଅଧିକାଂଶ HCoV-229E NiRAN ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ସମ୍ଭବ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3E) |ଅଣ-କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାଇରାଲ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟଗୁଡିକର ଏକ ଗୋଷ୍ଠୀ ବିକଳ୍ପ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରେ ଯାହା ଭିଟ୍ରୋ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) ରେ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ହଟାଇବା କିମ୍ବା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରିବାକୁ ଦର୍ଶାଯାଇଛି, କିନ୍ତୁ ଅନ୍ୟ ଦୁଇଟି ବିକଳ୍ପ ଅଛି (K4116R, E4145A) 80 % ସଂରକ୍ଷିତ?ସେମାନଙ୍କର ଭିଟ୍ରୋ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଅତିରିକ୍ତ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଜଡିତ |ସେହିଭଳି, ଅନ୍ୟ ଦୁଇଟି ମ୍ୟୁଟେସନ୍ (R4178K, F4281A) ଯାହା NiRAN ର ଭିଟ୍ରୋ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ମଧ୍ୟମ ହ୍ରାସ ଘଟାଇଲା ଜୀବନ୍ତ ଜୀବାଣୁ ଉତ୍ପାଦନ କଲା, ତଥାପି, ଏହି ଜୀବାଣୁଗୁଡ଼ିକ ନକଲ ମାଧ୍ୟମରେ ଟାଇଟର୍ କୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କଲେ |ଚିତ୍ର 3D ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ତଥ୍ୟ ସହିତ ସ୍ଥିର, ଅନ୍ୟ ଚାରିଟି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ବଦଳାଇ ଯାହା କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ / କିମ୍ବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ଜୀବନ୍ତ ଜୀବାଣୁ ଉତ୍ପାଦନ କଲା ସତ୍ତ୍ .େ, ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ଜୀବାଣୁ (ଚିତ୍ର 3E) ତୁଳନାରେ ଏକ ମଧ୍ୟମ ହ୍ରାସ ହୋଇଥିବା ଟାଇଟର୍ |
NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସକ୍ରିୟ RdRp ଡୋମେନ୍ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ କି ନାହିଁ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ, RdRp ମୋଟିଫ୍ C ରେ ବିଭାଜିତ ଧାତୁ ଆୟନ (11) ର ସମନ୍ୱୟରେ ଜଡିତ ଦୁଇଟି ସଂରକ୍ଷିତ Asp ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଆଲା ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥାନିତ କରାଯାଇଥିଲା | ଫଳସ୍ୱରୂପ ପ୍ରୋଟିନ୍ nsp12_DD4823 / 4AA ରହିଥାଏ | ଏହାର nsp9 NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଭିଟ୍ରୋ nsp9 ରେ ମଧ୍ୟସ୍ଥ ମଧ୍ୟସ୍ଥ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ନାହିଁ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S4) |
Nsp12 ପାଇଁ nsp9- ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପ୍ରତିଷ୍ଠା କରିବା ପରେ, ଆମେ NMP-nsp9 ଆଡକ୍ଟକୁ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS) ଦ୍ୱାରା ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରିଥିଲୁ |ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ HCoV-229E nsp9 ର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ 12,045 Da (ଚିତ୍ର 4A) ରେ ଏକ ଶିଖର ଦେଖାଇଲା |Nsp12 ର ଯୋଗ, nsp9 ର ଗୁଣବତ୍ତା ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିନାହିଁ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ nsp12 ଏବଂ nsp9 ବ୍ୟବହୃତ ଅବସ୍ଥାରେ ଏକ ସ୍ଥିର ଜଟିଳତା ସୃଷ୍ଟି କରିବ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 4A) |UTP ଏବଂ GTP ର ଉପସ୍ଥିତିରେ, ଯଥାକ୍ରମେ nsp9 ଏବଂ nsp12 ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ବହୁ ପରିମାପ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ UTP ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ମାସ 306 Da ଘୁଞ୍ଚିଛି, ଏବଂ GTP ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ମାସ 345 Da ଘୁଞ୍ଚିଛି, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ nsp9 ଅଣୁ ଏକ UMP କିମ୍ବା GMP ବାନ୍ଧେ | (ଚିତ୍ର 4) C ଏବଂ D) |ଏହା ଅନୁମାନ କରାଯାଏ ଯେ NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 NMPylation ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ଶକ୍ତି NTP ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଏବଂ ପିରୋଫୋସଫେଟ୍ ରିଲିଜ୍ ରୁ ଆସିଥାଏ |ଯଦିଓ ଏହି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ nsp12 (ଏନଜାଇମ୍) ଅପେକ୍ଷା nsp9 (ଟାର୍ଗେଟ୍) ର 10 ଗୁଣା ମୋଲାର ଅତିରିକ୍ତ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, nsp9 ର ପ୍ରାୟ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ NMPylation ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା, ଏହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ nsp12 ଏବଂ nsp9 ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ସ୍ୱଳ୍ପ ସମୟର ଅଟେ, ଏବଂ nsp12 NMPylate ଅଧିକ nsp9 କରିପାରିବ | ଭିଟ୍ରୋ ଅଣୁରେ |
Nsp12 ଏବଂ UTP କିମ୍ବା GTP ର ଉପସ୍ଥିତିରେ nsp9 ର ଏକକ NMPylation |HCoV-229E nsp9 (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ସାରଣୀ S1) (AD) ର ଡିକୋନଭୋଲ୍ୟୁଟେଡ୍ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି |(A) ଏକାକୀ nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ଉପସ୍ଥିତିରେ, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ଉପସ୍ଥିତିରେ |
Nsp9 ଅବଶିଷ୍ଟ NMP12 ଦ୍ U ାରା UMPylated ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ, nsp9-UMP ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ ସହିତ ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡ ହୋଇଗଲା |ଫଳସ୍ୱରୂପ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡିକ ନାନୋ-ଉଚ୍ଚ କ୍ଷମତା ସମ୍ପନ୍ନ ତରଳ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (HPLC) ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅନଲାଇନରେ ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS / MS) ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ବାୟୋନିକ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍ (ପ୍ରୋଟିନ୍ ମେଟ୍ରିକ୍ସ) ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ବିଶ୍ଳେଷଣ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ର UMPylation ଦେଖାଇଲା |ଏହା ହସ୍ତକୃତ ଭାବରେ ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଛି |ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ [UMP] NNEIMPGK (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S5A) ର ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ 421 m / z ରେ ଏକ ଖଣ୍ଡ ପ୍ରକାଶ କଲା, ଯାହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ UMP nsp9 ର ଅବଶିଷ୍ଟ 1 ସହିତ ବାନ୍ଧେ |
Nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସରେ, ଆସନ୍ ଅର୍ଥୋରୋରୋନାଭିରିନା (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S6) ର ସଦସ୍ୟମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ସଂରକ୍ଷିତ |ଯଦିଓ ଆମେ ବିଶ୍ believe ାସ କରୁ ଯେ N- ଟର୍ମିନାଲ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ ନାଇଟ୍ରୋଜେନ UMP ପାଇଁ ସର୍ବାଧିକ ଗ୍ରହଣକାରୀ, ଆମେ N- ଟର୍ମିନାଲରେ NMP ବାନ୍ଧିବାର ଅତିରିକ୍ତ ପ୍ରମାଣ ପାଇବାକୁ ସ୍ଥିର କଲୁ |ଏହି କାରଣରୁ, HPLC ଦ୍ pur ାରା ଶୁଦ୍ଧ ହୋଇନଥିବା NMPylated ଏବଂ NMPylated N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ nsp9 ଏସିଟୋନ୍ ଏବଂ ସୋଡିୟମ୍ ସିଆନୋବୋରୋହାଇଡ୍ରାଇଡ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ସର୍ତ୍ତଗୁଡିକରେ, କେବଳ ମାଗଣା ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନଗୁଡିକ ପ୍ରୋପିଲ୍ (25) ସହିତ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇପାରିବ |NNEIMPGK କ୍ରମ ସହିତ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ nsp9- ଉତ୍ପାଦିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଦୁଇଟି ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ ଧାରଣ କରେ, ଗୋଟିଏ ଆସନର N- ଟର୍ମିନାସରେ ଏବଂ ଅନ୍ୟଟି C- ଟର୍ମିନାସରେ ଲାଇସର ପାର୍ଶ୍ୱ ଶୃଙ୍ଖଳରେ |ତେଣୁ, ପ୍ରପିଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀଗୁଡିକ ଉଭୟ ମୁଣ୍ଡରେ ପରିଚିତ ହୋଇପାରିବ |ଅଣ- NMPylated ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ବାହାର କରାଯାଇଥିବା ଆୟନ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାମ୍ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S5B ରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଏବଂ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ (ମୋନୋ) ପ୍ରୋଫାଇଲଡ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S5B, ଉପର ଗାଡ଼ି) ଏବଂ ଡିପ୍ରୋପିଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S5B, ନିମ୍ନ ଗାଡ଼ି) ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ |Nsp9 ର NMPylated N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର ସହିତ ଏହି pattern ାଞ୍ଚା ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୁଏ |ଏହି ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ, କେବଳ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ, କିନ୍ତୁ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଏବଂ ଡିପ୍ରୋପାଇଲେଟେଡ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ନାହିଁ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S5C), ଏହା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ UMP କୁ N- ଟର୍ମିନାଲ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରାଯାଇଛି | ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିବା ପାଇଁ ଗୋଷ୍ଠୀ |
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ଲକ୍ଷ୍ୟ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରତିବନ୍ଧକକୁ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିବା ପାଇଁ nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ (ଆଲା କିମ୍ବା ସେର୍ ସହିତ) ବଦଳାଇଥାଉ |ଆମର MS ତଥ୍ୟ ଉପରେ ଆଧାର କରି ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ NiRAN nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାଲ ଅବଶିଷ୍ଟ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ ସହିତ ଏକ nsp9-NMP ଆଡକ୍ଟ ଗଠନ କରେ, ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ nsp9 NMP ଟର୍ମିନାଲରୁ nsp9 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ମୁକ୍ତ କରିବାକୁ nsp9 NMPylation ଭାଇରାଲ୍ ମାଷ୍ଟର ପ୍ରୋଟିସ୍ (Mpro, nsp5) ଆବଶ୍ୟକ କରେ | ଏହାର ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ |ଏହି ଅନୁମାନ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ, ଆମେ ଇ କୋଲିରେ nsp9 ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ nsp7-11 ଉତ୍ପାଦନ କରିଥିଲୁ ଏବଂ [α-32P] UTP (ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତି) ଉପସ୍ଥିତିରେ ଏକ ମାନକ NMPylation ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ |ଚିତ୍ର 5A (ଗାଡ଼ି 3) ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି, ଅଙ୍କିତ nsp7-11 ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ nsp12 ସହିତ ରେଡିଓଲାବେଲ ହୋଇନାହିଁ |ଏହାର ବିପରୀତରେ, ଯଦି nsp7-11 ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀରୁ nsp9 (ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ nsps) ମୁକ୍ତ କରିବାକୁ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ nsp5 ଦ୍ cle ାରା ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡ ହୋଇଯାଏ, nsp9 ସହିତ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ଏକ ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ ହୁଏ, ଯାହା ଆମର ସିଦ୍ଧାନ୍ତକୁ ପ୍ରମାଣ କରେ ଯେ NiRAN ଏବଂ N- କୋଭାଲାଣ୍ଟ nsp9-NMP ଆଡକ୍ଟସ୍ ର ଚୟନକାରୀ ଗଠନ | ।N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆସନ୍ ର ଟର୍ମିନାଲ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ (pp1a / pp1ab ରେ ସ୍ଥିତି 3825) |ଏହି ସିଦ୍ଧାନ୍ତ nsp9 ନିର୍ମାଣକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ପରୀକ୍ଷଣ ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟ ସମର୍ଥିତ, ଯାହାକି N- ଟର୍ମିନାସରେ ଗୋଟିଏ କିମ୍ବା ଦୁଇଟି ଅତିରିକ୍ତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଧାରଣ କରିଥାଏ |ଉଭୟ ମାମଲାରେ, nsp9 ର NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylation ରଦ୍ଦ କରାଯାଇଥିଲା (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S7) |ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାଲରେ 3825-NNEIMPK-3832 ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମରୁ ଏକ କିମ୍ବା ଦୁଇଟି ଆସନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ସହିତ ଏକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରିଥିଲୁ |ଉଭୟ କ୍ଷେତ୍ରରେ, nsp9 UMPylation ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ରୂପେ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5 ବି), ପ୍ରକୃତ nsp9 N- ଟର୍ମିନାସ୍ ଏକ NMP ରିସେପ୍ଟର ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ ବୋଲି ଅତିରିକ୍ତ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରିଥାଏ |
Nsp9 ର ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ଏବଂ nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylation ରେ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ ଭୂମିକା |(କ) nsp9 UMPylation ଏକ ମାଗଣା nsp9 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |Nsp7-11-His6 NMPylation ଚିହ୍ନଟ ବଫର୍ରେ 30 ° C ରେ ପ୍ରି-ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ହୋଇଛି ଯାହାକି ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ Mpro (nsp5-His6) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ UTP ଧାରଣ କରିଥାଏ |3 ଘଣ୍ଟା ପରେ, ସାମଗ୍ରୀ ଏବଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି nsp12-His6 ଯୋଗ କରି NMPylation ଅନୁଧ୍ୟାନ ଆରମ୍ଭ କରନ୍ତୁ |ଏକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ nsp5-His6 (ଗାଡ଼ି 1) ଏବଂ nsp9-His6 (ଗାଡ଼ି 2) ଧାରଣ କରିଥିବା ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |୧୦ ମିନିଟ୍ ପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବନ୍ଦ ହୋଇଗଲା ଏବଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣକୁ SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ଅଲଗା କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ ବ୍ଲୁ (ଏ, ଟପ୍) ସହିତ ଦାଗଯୁକ୍ତ |Nsp7-11-His6 ପୂର୍ବାବଲୋକନ ଏବଂ nsp5-His6 ମଧ୍ୟସ୍ଥି ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡରୁ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୃତ ଉତ୍ପାଦ ଡାହାଣରେ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ଦୟାକରି ଧ୍ୟାନ ଦିଅନ୍ତୁ (ସେମାନଙ୍କର ଛୋଟ ଆକାର ହେତୁ) ଯେ nsp7 ଏବଂ nsp11-His6 ଏହି ଜେଲରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇପାରିବ ନାହିଁ, ଏବଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା nsp5-His6 (ଗାଡ଼ି 1 ଏବଂ 4; nsp5-His6 ର ସ୍ଥିତି ଏକ ଦୃ solid ବୃତ୍ତ ଦ୍ୱାରା ସୂଚିତ) | କିମ୍ବା nsp9-His6 (ଲେନ୍ 2) ଅଳ୍ପ ପରିମାଣର MBP (ଖୋଲା ସର୍କଲ୍ ଦ୍ୱାରା ସୂଚିତ) ଅବଶିଷ୍ଟ ଅପରିଷ୍କାର ଭାବରେ ଧାରଣ କରିଥାଏ କାରଣ ସେଗୁଡିକ MBP ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ସାରଣୀ S1) ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ |)କୁମାସି ସହିତ ଦାଗଯୁକ୍ତ B, SDS-PAGE ଉପରେ, B, ସଂପୃକ୍ତ ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫ୍ ନିମ୍ନରେ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି |ବାମ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ମଲିକୁଲାର ଓଜନ ମାର୍କର ସ୍ଥିତି (କିଲୋଡାଲ୍ଟନରେ) ଦର୍ଶାଯାଇଛି |(C) HCoV-229E nsp9-His6 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ ଆଲା କିମ୍ବା ସେର୍ ସହିତ ବଦଳାଯାଇଥିଲା ଏବଂ nsp12-His6 ମଧ୍ୟସ୍ଥି UMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ସମାନ ପରିମାଣର ପ୍ରୋଟିନ୍ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ SDS-PAGE ଦ୍ separated ାରା ଅଲଗା ହୋଇ କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ ବ୍ଲୁ (ସି, ଟପ୍) ସହିତ ଦାଗଯୁକ୍ତ ଏବଂ ଫସଫୋରସେନ୍ସ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ (C, ମଧ୍ୟମ) ଦ୍ୱାରା ରେଡିଓଲାବେଲଡ୍ nsp9-His6 ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ (wt) ପ୍ରୋଟିନ୍ କୁ ଏକ ରେଫରେନ୍ସ (100% ସେଟ୍) ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆପେକ୍ଷିକ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (ଅର୍ଥାତ୍ ± SEM) ତିନୋଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ପରୀକ୍ଷଣରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |(ଘ) HCoV-229E ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ହୁ -7 କୋଷରେ ସଂକ୍ରମିତ ହୁ -7 କୋଷଗୁଡ଼ିକର p1 କୋଷ ସଂସ୍କୃତିର ଅଲ ern କିକ ଜୀବାଣୁ, ଏବଂ nsp9 ରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ବହନ କରୁଥିବା ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟଗୁଡିକ ପ୍ଲେକ୍ ଆସେ ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ନକଲ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ନକଲ-ଅଭାବ RdRp motif C ଡବଲ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ DD4823 / 4AA ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |
Nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସ୍ (ବିଶେଷକରି ପଦବୀ 1, 2, 3, ଏବଂ 6) ଅର୍ଥକୋରୋନାଭିରିନା ସବଫ୍ୟାମିଲି (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S6) ର ସଦସ୍ୟମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସଂରକ୍ଷିତ |Nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 NMPylation ରେ ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଭୂମିକା ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ, nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସରେ କ୍ରମାଗତ ଦୁଇଟି Asn ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଆଲା କିମ୍ବା ସେର୍ (ଏକାକୀ କିମ୍ବା ମିଶ୍ରଣରେ) ସହିତ ବଦଳାଗଲା |ୱାଇଲ୍ଡ-ଟାଇପ୍ nsp9 ସହିତ ତୁଳନା କଲେ, N3825 କୁ ଆଲା କିମ୍ବା ସେର୍ ସହିତ ବଦଳାଇବା ଦ୍ୱାରା nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylation (ଚିତ୍ର 5C) ରେ ଦୁଇଗୁଣ ହ୍ରାସ ଘଟିଲା |ଆମର ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ସହିତ ସ୍ଥିର ଯେ NMPylation N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ ପାର୍ଶ୍ୱ ପାର୍ଶ୍ୱ ଶୃଙ୍ଖଳା ପରିବର୍ତ୍ତେ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନରେ ଘଟିଥାଏ, ଆମେ N3825A ଏବଂ N3825S ର ବଦଳ ସହିତ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଅବଶିଷ୍ଟ NMPylation ଦେଖିଲୁ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଯଦି ଦ୍ୱିତୀୟ ଆସନ୍ ଆଲା କିମ୍ବା ସେର୍ ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥାନିତ ହୁଏ, nsp9 UMPylation ଅଧିକ ଦୃ strongly ଭାବରେ (10 ଗୁଣରୁ ଅଧିକ) ହ୍ରାସ ହୋଇଥିବାବେଳେ 3, 4, ଏବଂ 6 ସ୍ଥିତିରେ ଆଲାଙ୍କ ବଦଳ କେବଳ nsp9 UMPylation ଉପରେ ମଧ୍ୟମ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ (ଚିତ୍ର 2 | )5C)ସମାନ ଫଳାଫଳ ATP, CTP କିମ୍ବା GTP (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S8) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |ଏକତ୍ରିତ ଭାବରେ, ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ nsp9 NMPylation ରେ N2826 (nsp9 ରେ ସ୍ଥିତି 2) ର ମୁଖ୍ୟ ଭୂମିକା ସୂଚାଇଥାଏ |
Nsp9 ଏବଂ NMPylation ର N- ଟର୍ମିନାସ୍ ମଧ୍ୟରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ଅତିରିକ୍ତ ପ୍ରମାଣ ପାଇବାକୁ, ଆମେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାରର nsp9 କ୍ରମର ଏକାଧିକ କ୍ରମ ଆଲାଇନ୍ମେଣ୍ଟ (MSA) ସଂପାଦନ କରିଥିଲୁ (104 ରୁ 113 ଅବଶିଷ୍ଟ ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ) (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର) S6) |ମୋଟାମୋଟି ଭାବେ, Orthocoronavirinae subfamily ର 5 ଟି ଜେନେରାର 47 (ଜଣାଶୁଣା ଏବଂ ପୁଟିଭ୍) ପ୍ରଜାତିରେ, ଯାହା ବିଭିନ୍ନ ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ପ୍ରାଣୀ, ପକ୍ଷୀ ଏବଂ ସରୀସୃପ ହୋଷ୍ଟକୁ ସଂକ୍ରମିତ କରେ, ମୋଟ 8 ଟି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଅବ arian ଧ ବୋଲି ଜଣାପଡିଛି |ବିଲୋପନ ଏବଂ ସନ୍ନିବେଶକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି ସର୍ବାଧିକ ବ୍ୟାପକ ପରିବର୍ତ୍ତନ, nsp9 ର ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ଉପାଦାନ ମଧ୍ୟରେ ଥିବା ଚକ୍ରରେ ଦେଖାଗଲା, ଯେପରି ପୂର୍ବ ଗଠନମୂଳକ ଅଧ୍ୟୟନ (26 ?? 28) ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |Nsp9 ର C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଂଶର β ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ଏବଂ α ହେଲିକ୍ସରେ ପାଞ୍ଚଟି ଅବ arian ଧ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ମିଳିଲା |ତିନୋଟି ଅବ arian ଧ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ nsp9 ର N ଟର୍ମିନାସର NNE ମୋଟିଫ୍ ଗଠନ କରେ |ଏହା ପ୍ରକାଶ ପାଇଛି ଯେ ଏହି ମୋଟିଫ୍ ର ଦ୍ୱିତୀୟ ଆସନ୍ ହେଉଛି ଏକମାତ୍ର ଅବ arian ଧ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ, ଯାହା ଦୂର ସମ୍ପର୍କିତ ବେଙ୍ଗ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର ହାଇପୋଥେଟିକାଲ୍ nsp9 ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟ ଅଂଶୀଦାର ହୋଇଛି ଏବଂ ଆଲଫାଲେଟୋଭାଇରସ୍ ସବ୍ଫ୍ୟାମିଲି ଲେଟୋଭାଇରିନାରେ ମାଇକ୍ରୋହିଲା ଲେଟୋଭାଇରସ୍ species ପ୍ରଜାତିର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |Nsp9 ଦ୍ secondary ିତୀୟ ସଂରଚନା ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକରେ ଅବଶିଷ୍ଟ ସଂରକ୍ଷଣକୁ ଫୋଲ୍ଡିଂ କିମ୍ବା ଜଣାଶୁଣା RNA ବନ୍ଧନ ଗୁଣଗୁଡିକ ବଜାୟ ରଖିବା ପାଇଁ ଗଠନମୂଳକ ବିଚାର ଦ୍ୱାରା ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ କରାଯାଇପାରେ |ତଥାପି, ଏହି ଯୁକ୍ତି NNE ର ସଂରକ୍ଷଣ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ମନେହୁଏ ନାହିଁ, ଏବଂ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ ପୂର୍ବରୁ, ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମର ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ସୀମିତ କରୁଥିବା ପ୍ରତିବନ୍ଧକଗୁଡିକର ପ୍ରକୃତି ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଅନ୍ଧକାର ହୋଇଯାଇଥିଲା |
କରୋନାଭାଇରସ୍ ନକଲରେ nsp9-NMPylation ଏବଂ NNE ସଂରକ୍ଷଣର ମହତ୍ତ୍ determine ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ, ଆମେ HCoV-229E ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଉତ୍ପାଦନ କଲୁ, ଯାହା nsp9 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡ଼ିକର ଏକକ କିମ୍ବା ଦୁଇଥର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ବହନ କରେ, ଯାହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ nsp9 NMPylation ଭିଟ୍ରୋରେ କ୍ଷତିକାରକ |ଆମେ ଆରମ୍ଭ କରିବା ପୂର୍ବରୁ, ଆମେ ପ୍ରଶ୍ନର ଉତ୍ତର ଦେବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରୁ କି ଏହି ପ୍ରତିସ୍ଥାପନଗୁଡିକ (nsp8 | 9 କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟ୍ ନିକଟରେ) C- ଟର୍ମିନାଲ୍ pp1a ଅଞ୍ଚଳର ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ କି?Nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସରେ ଅନୁରୂପ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଧାରଣ କରିଥିବା nsp7-11 ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ ନିର୍ମାଣଗୁଡ଼ିକର ଏକ ସେଟ୍ ଇ କୋଲିରେ ଉତ୍ପାଦିତ ହେଲା ଏବଂ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ Mpro ସହିତ କଟା ହେଲା |ଚାରୋଟି ସାଇଟର ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ କ୍ଲାଭେଜ୍ (nsp9 ଫ୍ଲାଙ୍କିଙ୍ଗ୍ ସାଇଟ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି) କ introduced ଣସି ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S9) ଦ୍ୱାରା ବିଶେଷ ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ ନାହିଁ, ଏହି ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଗଠନମୂଳକ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ବାଦ ଦେଇ Mpro- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp8 | 9 ଖଣ୍ଡ (କିମ୍ବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ) ରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି କରେ | ୱେବସାଇଟ୍ |
Huh-7 କୋଷଗୁଡିକ ଜେନୋମ-ଲମ୍ବ HCoV-229E RNA ସହିତ ସଂକ୍ରମିତ ହୋଇଥିଲା, nsp9 N ଟର୍ମିନାସରେ ସଂରକ୍ଷିତ NNE ଟ୍ରାଇପେପ୍ଟାଇଡ୍ (N3825, N3826, ଏବଂ E3827) ରେ ଆଲା କିମ୍ବା ସେର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନକୁ ଏନକୋଡିଂ କରି ଦର୍ଶାଯାଇଥିଲା ଯେ ଅଧିକାଂଶ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସାଂଘାତିକ ଅଟେ |ଆମେ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆସନ୍ (N2835A କିମ୍ବା N2835S) ର ସେର କିମ୍ବା ଆଲାକୁ ବଦଳାଇ ଜୀବାଣୁ ଉଦ୍ଧାର କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲୁ, କିନ୍ତୁ NNE କ୍ରମରେ (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, ଅନ୍ୟ ଏକକ ଏବଂ ଦ୍ୱିଗୁଣ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ଜୀବାଣୁ ପୁନରୁଦ୍ଧାର କରିବାରେ ବିଫଳ ହୋଇଥିଲୁ | NN3825 / 6SS), E3827A) (ଚିତ୍ର 5D) |
ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଟିସୁ ସଂସ୍କୃତିରେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର ନକଲ ସୀମିତ (ସମାନ କିମ୍ବା ସମାନ), ଶରୀରରେ nsp9 NMPylation ସାଇଟଗୁଡିକର ପ୍ରାକୃତିକ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ସୀମିତ କରିଥାଏ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ଜୀବନଚକ୍ରରେ ଏହି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ପ୍ରମୁଖ ଭୂମିକାକୁ ସମର୍ଥନ କରେ |
ପରୀକ୍ଷଣର ଶେଷ ସେଟ୍ ରେ, ଆମେ C- ଟର୍ମିନାଲ୍ His6 ନାମକ SARS-CoV-2 nsp12 ଏବଂ nsp9, ଏବଂ E. coli ରେ nsp12 ର ଦୁଇଟି ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ଫର୍ମ ଉତ୍ପାଦନ କଲୁ |NiRAN ଏବଂ RdRp ଡୋମେନଗୁଡିକରେ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକ ଯଥାକ୍ରମେ ଆଲା ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (ଚିତ୍ର 6A ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ସାରଣୀ S2) |SARS-CoV-2 nsp12 ରେ K4465 HCoV-229E (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S2) ରେ K4135 ସହିତ ଅନୁରୂପ ଅଟେ, ଯାହା NiRAN କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ HCoV-229E ନକଲ (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ E) ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ବୋଲି ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ EAV nsp9 K94 ଅବଶିଷ୍ଟ ସହିତ ମଧ୍ୟ ଅନୁରୂପ ଅଟେ, ଯାହା ପୂର୍ବରୁ NiRAN ସ୍ - UMPylation / self-GMPylation (16) ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ ବୋଲି ଦର୍ଶାଯାଇଥିଲା |ଚିତ୍ର 6B ରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି, SARS-CoV-2 nsp12 ରେ nsp9 କୁ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରି UMP ସ୍ଥାନାନ୍ତର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଥିବାବେଳେ nsp12_K4465A ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ନିଷ୍କ୍ରିୟ ଅଟେ |RdRp motif C ର SDD ଚରିତ୍ରିକ କ୍ରମରେ ଡବଲ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ UMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 6B), ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ nsp9 UMPylation ରେ RdRp କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର କ direct ଣସି ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ପ୍ରଭାବ ନାହିଁ |CTP, GTP ଏବଂ ATP (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S10) ବ୍ୟବହାର କରି ସମାନ ତଥ୍ୟ ମିଳିଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, ଏହି ତଥ୍ୟ ସୂଚିତ କରେ ଯେ NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 NMPylation ର କରୋନାଭାଇରସରେ ଏକ ରକ୍ଷଣଶୀଳ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅଛି ଯାହା ଅର୍ଥୋରୋନାଭାଇରସ୍ ସବଫ୍ୟାମିଲିର ବିଭିନ୍ନ ଜେନେରାର ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |
SARS-CoV-2 nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ NMPylation nsp9 |(କ) NMPylation ପରୀକ୍ଷଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଉଥିବା କୁମାସି ଦାଗଯୁକ୍ତ SDS- ପଲିୟାକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଜେଲ୍ |ଏକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ, SARS-CoV-2 nsp12 ର NiRAN ଡୋମେନ୍ (K4465A) ଏବଂ RdRp ଡୋମେନ୍ (DD5152 / 3AA) ରେ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ସହିତ ଏକ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଅବଶିଷ୍ଟ ସଂଖ୍ୟାକରଣ pp1ab ରେ ଅବସ୍ଥାନ ଉପରେ ଆଧାରିତ |(ଖ) nsp9-His6 ଏବଂ [α-32P] UTP କୁ nsp12-His6 (ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର [wt] ଏବଂ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ) ର ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ UMPylation ଚିହ୍ନଟର ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫ୍ |ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନର ମଲିକୁଲାର୍ ଭ୍ୟାସ୍ (କିଲୋଡାଲ୍ଟନ୍ରେ) ବାମରେ ଦେଖାଯାଏ |
NiRAN ଡୋମେନ୍ ଗୁଡିକ ସାଧାରଣତ N Nidovirales (16) ରେ ସଂରକ୍ଷିତ ହୋଇ ରହିଥାଏ, ଯାହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ ସେମାନେ ନିଡୋଭାଇରସ୍ ନକଲ ପାଇଁ ଜରୁରୀ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରନ୍ତି |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ଆମେ ପ୍ରମାଣ କରିବାକୁ ସମର୍ଥ ହେଲୁ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର NiRAN ଡୋମେନ୍ NMP (NTP ରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ) କୁ nsp9 କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରେ, ଜୀବାଣୁ ନକଲ (26 ?? 29) ସହିତ ଜଡିତ ଏକ ରହସ୍ୟମୟ RNA ବାଇଣ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍, ଏହାକୁ ଏକ ପ୍ରାକୃତିକ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ଆରଟିସିର ଅଂଶୀଦାର |
NiRAN ଡୋମେନ୍ ତିନୋଟି କ୍ରମ ମୋଟିଫ୍ (AN, BN, ଏବଂ CN) ଅଂଶୀଦାର କରେ, ଯେଉଁଥିରେ ବହୁତ କମ୍ ସଂଖ୍ୟକ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ରହିଥାଏ ଯାହା ମୋନୋଫାଇଲେଟିକ୍ କିନ୍ତୁ ବହୁ ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ ନିଡୋଭାଇରାଲସ୍ କ୍ରମରେ ସଂରକ୍ଷିତ (8, 16) |ସାମ୍ପ୍ରତିକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ସେମାନେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସ୍ ପରି ପ୍ରୋଟିନର ଏକ ଅଣସଂଗଠିତ ପରିବାର ସହିତ ଗଠନମୂଳକ ଭାବରେ ଜଡିତ, ଯାହାକୁ ପ୍ରଥମେ ସେଲୋ ପରିବାର କୁହାଯାଉଥିଲା (17, 19, 22, 30, 31) |ସେଲୋ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକରେ କିନାସ୍ ଫୋଲ୍ଡ ଅଛି, କିନ୍ତୁ ଶାସ୍ତ୍ରୀୟ କିନାସ୍ (22, 32) ରେ ଅନେକ ସଂରକ୍ଷିତ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ ଅଭାବ |ସକ୍ରିୟ ସାଇଟରେ ବନ୍ଧା ହୋଇଥିବା ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଦ୍ abil ାରା ସ୍ଥିର ହୋଇଥିବା ATP ଅଣୁଗୁଡ଼ିକର ଓଲଟା ଆଭିମୁଖ୍ୟ ଉପରେ ଆଧାର କରି, SelO ଅନୁମାନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ (22) କୁ AMP (ଫସଫେଟ୍ ବଦଳରେ) ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିବାକୁ ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଥିବାବେଳେ ଅନ୍ୟ ଏକ ଜୀବାଣୁ SelO ପରି ପ୍ରୋଟିନ୍ YdiU ଅଛି | ନିକଟରେ UMP ର ଟାୟାର ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ର ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର କୋଭାଲାଣ୍ଟ ସଂଲଗ୍ନକୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରିବାକୁ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |
କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ପୁଟିଭ୍ ଆକ୍ଟିଭ୍ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟଗୁଡିକର ଭବିଷ୍ୟବାଣୀକୁ ନିଶ୍ଚିତ ଏବଂ ବିସ୍ତାର କରିବାକୁ, ଆମେ କରୋନାଭାଇରସ୍ nsp12 (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ E ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ ସାରଣୀ) S1â ଉପରେ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଆନାଲିସିସ୍ କରିବା ପାଇଁ ବାୟୋକେମିକାଲ୍ ଏବଂ ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ | S4) |ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଏ ଯେ HCoV-229E K4135, R4178 ଏବଂ D4280 କୁ ଆଲା ସହିତ ବଦଳାଇବା ଭିଟ୍ରୋ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ଜୀବାଣୁ ନକଲକୁ ଦୂର କରିଥାଏ (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ E ଏବଂ SI ଅନୁକ୍ରମଣିକା, ଚିତ୍ର S3), NTP γ- ଫସଫେଟ୍ ରେ ସେମାନଙ୍କର ଉପସ୍ଥିତିକୁ ସମର୍ଥନ କରେ | (K4135, R4178) ଏବଂ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଧାତୁ ଆୟନ (D4280) ର ସମନ୍ୱୟ |ପକ୍ଷୀମାନଙ୍କର ବସା ଜୀବାଣୁ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଗ୍ଲୁ ର E4145A ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ, K4135 (17) ସ୍ଥିତିକୁ ସ୍ଥିର କରିବାକୁ ପୂର୍ବାନୁମାନ କରାଯାଇଥିବା ଭାଇରାଲ୍ ନକଲକୁ ଦୂର କରିବା ପାଇଁ ଦର୍ଶାଯାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟର କଥା, ଭିଟ୍ରୋ NMPylation ଆସେ (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ E ଏବଂ) ରେ ଏହି କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ରଖାଯାଇଥିଲା | SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ ଟେବୁଲ୍ S1 - S4) |ସଲମାନେଲା ଟାଇଫାଇମରିୟମ୍ (E130A) (33) ର YdiU ହୋମୋଲୋଜିରେ ସଂପୃକ୍ତ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଆରମ୍ଭ ହେବାପରେ ଏକ ସମାନ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡିକ କାଟାଲାଇଟିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟ ଅପେକ୍ଷା ଏହି ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟ ନିୟାମକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ସମର୍ଥନ କରେ |
ସଂରକ୍ଷିତ ଫେ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ (F4281A) କୁ HCoV-229E NiRAN ଡୋମେନ୍ (8) ରେ ନେଷ୍ଟୋଭାଇରସ୍ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ବଦଳାଇବା ଦ୍ vit ାରା ଭିଟ୍ରୋରେ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ହ୍ରାସ ପାଇଲା ଏବଂ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ଜୀବାଣୁ ନକଲରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ହ୍ରାସ ହେଲା (ଚିତ୍ର 3D, E ଏବଂ SI) ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S3) |ତଥ୍ୟ ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶର ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନିୟାମକ କାର୍ଯ୍ୟ ସହିତ ସମାନ, ଯେପରିକି ପୂର୍ବରୁ ଦେଖାଯାଇଥିବା ହୋମୋଲୋଜିସ୍ DFG ମୋଟିଫ୍ ଫେ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ |ଶାସ୍ତ୍ରୀୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସରେ, ଏହା Mg2 + ବାନ୍ଧିବା ଲୁପ୍ ର ଏକ ଅଂଶ ଏବଂ ମେରୁଦଣ୍ଡକୁ ଏକତ୍ର କରିବା ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ |??ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଅନୁଗାମୀ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ (32, 34) |K4116 ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ପାଇଁ (ପ୍ରିନ୍ ମୋଟିଫ୍ ରେ) ଆଲା ଏବଂ ଆର୍ଗକୁ ଯଥାକ୍ରମେ ଭାଇରାଲ୍ ନକଲକୁ ହଟାଇଲା ଏବଂ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ପାର୍ଶ୍ୱ ଶୃଙ୍ଖଳା (ଚିତ୍ର 3D ଏବଂ E ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଟ) ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ଭିଟ୍ରୋରେ NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଭାବ ପଡିଥିଲା | , ଚିତ୍ର S3) |କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ତଥ୍ୟ ଗଠନମୂଳକ ସୂଚନା ସହିତ ସମାନ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ATP ଫସଫେଟ୍ (17) ସହିତ ଏକ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ସ୍ଥାପନ କରିଛି |ଅନ୍ୟ ନଷ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଜୀବାଣୁ ପରିବାରର NiRAN ଡୋମେନ୍ ରେ, HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 ର ସ୍ଥିତି Lys, Arg କିମ୍ବା His (8) ଦ୍ occupied ାରା ଦଖଲ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଏହି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟର ପ୍ରତିବନ୍ଧକକୁ ଆରାମ ଦିଆଯାଇଛି |D4188A ଏବଂ D4283A ର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଦୂର କରିଥାଏ କିମ୍ବା ଦୃ strongly ଭାବରେ ହ୍ରାସ କରିଥାଏ ଏବଂ ଜୀବାଣୁ ନକଲକୁ ଦୂର କରିଥାଏ (ଚିତ୍ର 3) |ଏହି ଦୁଇଟି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଅଧିକାଂଶ (କିନ୍ତୁ ସମସ୍ତ ନୁହେଁ) ନଷ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଜୀବାଣୁ (8) ରେ ସଂରକ୍ଷିତ, ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପରିବାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କିନ୍ତୁ ସମ୍ଭବତ-ଅଣ-କାଟାଲାଇଟିସ୍ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ସୂଚାଇଥାଏ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ Lys ଏବଂ Asp ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ଆଲା ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (K4113A, D4180A, D4197A ଏବଂ D4273A) ଯାହା କରୋନାଭିରିଡା କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ ନେଷ୍ଟିଓଭାଇରିଡା ପରିବାରରେ ସଂରକ୍ଷିତ ନୁହେଁ (8) |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, ଏନ୍ଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପରେ ସାମାନ୍ୟ ହ୍ରାସ ଏବଂ କେତେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଭାଇରାଲ୍ ନକଲ ସହିତ ଏହି ପ୍ରତିସ୍ଥାପନଗୁଡିକ ମୁଖ୍ୟତ tole ସହନଶୀଳ (ଚିତ୍ର 3 ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S3) |ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, କରୋନାଭାଇରସ୍ ମ୍ୟୁଟେଜେନେସିସ୍ ତଥ୍ୟ ସ୍ -ୟଂ ଜିଏମ୍ପି ଏବଂ EAV NiRAN-RdRp (16) ର ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ ତଥ୍ୟ ସହିତ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସୁସଙ୍ଗତ, ଯେଉଁଥିରେ EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ଅର୍ଥୋଲୋଜି) ଅବଶିଷ୍ଟ K94 (HCoV- 229E K4135) ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସହିତ) R124 (R4178 ଅନୁରୂପ), D132 (D4188 ଅନୁରୂପ), D165 (D4280 ଅନୁରୂପ), F166 (F4281 ଅନୁରୂପ) |ଏହା ସହିତ, HCoV-229E ମ୍ୟୁଟେଜେନେସିସ୍ ତଥ୍ୟ ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା SARS-CoV ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ସ ତଥ୍ୟ (16) ସହିତ ସମାନ ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ, ଠିକ୍ ସେହିପରି ସିଏନ୍ ମୋଟିଫ୍ ଫେ-ଟୁ-ଆଲା ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ SARS-CoV_nsp12 The ସହିତ ସମାନ | ଫେନୋଟାଇପ୍ ବର୍ଣ୍ଣିତ -F219A ଏବଂ HCoV-229E_F4281A (ଚିତ୍ର 3 D ଏବଂ E ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ ସାରଣୀ S1-S4) |
EAV ଅର୍ଥୋଲୋଜିସ୍ (16) ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଏ, ଯାହାର UTP ଏବଂ GTP (ସ୍ୱୟଂ- NMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ) ପାଇଁ ଏକ ସ୍ପଷ୍ଟ ପସନ୍ଦ ଅଛି, ଆମର ଅଧ୍ୟୟନ ଦର୍ଶାଏ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ (HCoV-229E ଏବଂ SARS-CoV-2 ଦ୍ୱାରା ପ୍ରତିନିଧିତ୍)) ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ହୋଇପାରେ | ସମସ୍ତ ଚାରୋଟି NMP ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇଛି, ଯଦିଓ UMP ପାଇଁ ସାମାନ୍ୟ ପସନ୍ଦ ଅଛି (ଚିତ୍ର 1 ଏବଂ 3) |ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NTP ସହ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ର ଅପେକ୍ଷାକୃତ କମ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସମ୍ପ୍ରତି ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା SARS-CoV-2 nsp7 / 8/12/13 ସୁପରକମ୍ପୋସାଇଟ୍ ଗଠନ ସହିତ ସମାନ, ଯେଉଁଥିରେ ADP-Mg2 + NiRAN ର ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧିଥାଏ, କିନ୍ତୁ ଆଡେନାଇନ୍ ପାର୍ଟ ସହିତ ନୁହେଁ | ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ ଗଠନର (୧)) |ଆମର ଅଧ୍ୟୟନରେ, NMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବ୍ୟବହୃତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡର ପ୍ରକାର ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ପ୍ରୋଟିନ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S3) ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ କ different ଣସି ଭିନ୍ନ ପ୍ରଭାବ ପକାଇବ ନାହିଁ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରୁ କ a ଣସି ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓବେସର ବନ୍ଧନ ସହିତ ଜଡିତ ନୁହେଁ |କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ ଧମନୀ ଜୀବାଣୁଙ୍କ NiRAN ଡୋମେନରେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ବିଭିନ୍ନ NTP ସହ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ପସନ୍ଦଗୁଡ଼ିକର ଗଠନମୂଳକ ଭିତ୍ତିଭୂମି ଏବଂ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଜ bi ବିକ ମହତ୍ତ୍ studied ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ବାକି ରହିଲା;ସେଗୁଡ଼ିକ ସତ ହୋଇପାରେ କିମ୍ବା ନିଜ ନିଜ ଅଧ୍ୟୟନର ସୀମିତତା ହେତୁ ହୋଇପାରେ |ବର୍ତ୍ତମାନ, ଏହାକୁ ଏଡ଼ାଇ ଦିଆଯାଇପାରିବ ନାହିଁ ଯେ ଧମନୀ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ମଧ୍ୟରେ ସମାନତାକୁ ଧ୍ୟାନରେ ରଖି ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ NMPylator କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ସ୍ୱ-NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ତୁଳନାରେ) ଏକ ଭିନ୍ନ ସହ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ପସନ୍ଦ ରହିଛି | NiRAN ଡୋମେନ୍ ଏହାର ସୀମାରେ ଅଛି |କ୍ରମ-ଆଧାରିତ ତୁଳନା (16) |ସିଉଡୋକିନେଜ୍ ସେଲୋ ସହିତ ତୁଳନା, ଯାହା Mg2 + କୁ କୋଫାକ୍ଟର ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରେ, କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ ଧମନୀ ଜୀବାଣୁ NiRAN ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ Mn2 + (16) ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ (ଚିତ୍ର 3C ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S1) |UTP ପାଇଁ Mn2 + ନିର୍ଭରଶୀଳତା ଏବଂ ସ୍ପଷ୍ଟ ପସନ୍ଦ ହେଉଛି ପ୍ରୋଟିନ୍ NMPylators ର ଏକ ଅସାଧାରଣ ବ feature ଶିଷ୍ଟ୍ୟ, ଏବଂ ସଲମାନେଲା ଟାଇଫାଇମରିୟମ୍ ର YdiU ପ୍ରୋଟିନ୍ରେ ଏହା ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଛି, ଯାହା କୋଷକୁ ଚାପ ଇନଡକ୍ସନ୍ ସେଲ୍ ଏଟିପି ପୁଲରୁ ରକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ କଠିନ Mn2 + ନିର୍ଭରଶୀଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚାପେରୋନ୍ UMPylation କୁ ଅନୁକରଣ କରିଥାଏ | 33)
କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ ଏବଂ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସ୍ (17, 19) ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପ୍ରତି ବର୍ଣ୍ଣିତ ଗଠନମୂଳକ ସମାନତା NiRAN ର ଦକ୍ଷତା ପାଇଁ NMP କୁ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ରିପୋର୍ଟ କରିଥିବା ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଅତିରିକ୍ତ ସମର୍ଥନ ଯୋଗାଇଥାଏ |HCoV-229E ORF1a ଦ୍ୱାରା ଏନକୋଡ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉପରେ ସମ୍ଭାବ୍ୟ NiRAN ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ପାଇଁ ଆମେ ଆମର ସନ୍ଧାନକୁ ଧ୍ୟାନ ଦେଇଥିଲୁ, ଯାହା RTC ର ORF1b- ଏନକୋଡେଡ୍ ପ୍ରତିକୃତି (12, 35) କୁ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ କିମ୍ବା ପରୋକ୍ଷ ଭାବରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିବାକୁ ଜଣାଶୁଣା |ଆମର ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ nsp9 ର ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଏବଂ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NMPylation ପାଇଁ ଚରମ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ (ଚିତ୍ର 2) |ଯଦି ଟାର୍ଗେଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏକ ମୋଲାର ଅତିରିକ୍ତରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ ଯାହା ଏନଜାଇମ୍ (nsp12) ଠାରୁ 8 ରୁ 10 ଗୁଣ ଅଧିକ, ଏହା ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଛି ଯେ nsp9 ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ (ମୋନୋ) NMPized (ଚିତ୍ର 4) |ଆମେ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେଇଛୁ ଯେ nsp12 ଏବଂ nsp9 ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ସ୍ୱଳ୍ପ ସମୟର ଅଟେ ଏବଂ nsp9 ସହିତ (ଅନ୍ୟ ଆରଟିସି ସବନିଟ୍ ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ) ଏକ ସ୍ଥିର ଜଟିଳ ଗଠନ କରିବ ନାହିଁ |ଏହି ସିଦ୍ଧାନ୍ତ SARS-CoV ପ୍ରୋଟିମ୍ (35) ଉପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ଅଧ୍ୟୟନ ଦ୍ୱାରା ସମର୍ଥିତ |MS ବିଶ୍ଳେଷଣ nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାଲ ଅବଶିଷ୍ଟର ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନକୁ NMPylation ସାଇଟ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ଚିତ୍ର S5) ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କଲା |ଫସଫୋରାମିଡେଟ୍ ବଣ୍ଡ ଏବଂ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆମିନୋ ଗ୍ରୁପ୍ ଗଠନ, ନିରାନ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ସିଉଡୋମାନାସ୍ ସିରିଞ୍ଜ ସେଲୋ-ମଧ୍ୟସ୍ଥ AMPylation ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରୁ ପୃଥକ କରେ, ଯାହା ସେର, ଥ୍ର, କିମ୍ବା ଟାୟାର ଅବଶିଷ୍ଟ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଆଡକ୍ଟରେ O- ସଂଯୁକ୍ତ AMP ଗଠନକୁ ଅନୁକରଣ କରିଥାଏ | 22), ଏବଂ S. typhimurium YdiU O- ଲିଙ୍କ୍ (ଟାୟର୍ ସହିତ) ଏବଂ N- ଲିଙ୍କ୍ (ତାଙ୍କ ସହିତ) ପେପ୍ଟାଇଡ୍- UMP ଆଡକ୍ଟସ୍ ଗଠନ କରେ |ପ୍ରୋଟିନର ସେଲୋ ପରିବାରରେ ଉପଲବ୍ଧ ସୀମିତ ସୂଚନା ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଏହି ବୃହତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିବାରର ସଦସ୍ୟମାନେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍- NMP ଆଡକ୍ଟସ୍ ଗଠନରେ ବହୁତ ଭିନ୍ନ ଅଟନ୍ତି |ଏହା ଏକ ଆକର୍ଷଣୀୟ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅଧ୍ୟୟନର ଯୋଗ୍ୟ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ପ୍ରାପ୍ତ ତଥ୍ୟ ଆମକୁ ଅନୁମାନ କରିବାକୁ ଆଗେଇଲା ଯେ nsp9 ର NMPylation ଏକ ମାଗଣା N- ଟର୍ମିନାସ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଭାଇରାଲ୍ ନକଲ ପ୍ରସଙ୍ଗରେ, Mpro ଏବଂ pp1ab ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥ ହୋଇଥିବା ନକଲ ପଲିପ୍ରୋଟେନ୍ pp1a ରେ nsp8 | nsp9 ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ସାଇଟର ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ କ୍ଲାଭେଜ୍ ଦ୍ୱାରା ଏହା ପ୍ରଦାନ କରାଯିବ |ଅଧିକାଂଶ କରୋନାଭାଇରସରେ, ଏହି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସାଇଟ୍ (VKLQ | HCoV-229E ରେ NNEI) ଏବଂ ଅନ୍ୟ ସମସ୍ତ କରୋନାଭାଇରସ୍ Mpro କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ହେଉଛି ଆସନ୍ (ଅନ୍ୟ ଏକ ଛୋଟ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ, ଯେପରିକି ଆଲା, ସେର କିମ୍ବା ଗ୍ଲାଇ) P1â ଦଖଲ କରେ |??ଅବସ୍ଥାନ () 36) |ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଅଧ୍ୟୟନରେ ମିଳିଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ଲାଭେଜ୍ ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ nsp8 | nsp9 ସାଇଟର କ୍ଲାଭେଜ୍ ଦକ୍ଷତା ଅନ୍ୟ ସାଇଟ ତୁଳନାରେ କମ୍ ଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ 1) ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ର ଠିକ ସମୟରେ ସମନ୍ୱିତ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣରେ ଏହି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସାଇଟର ନିୟାମକ ଭୂମିକା ରହିପାରେ | pp1a ଅଞ୍ଚଳ, କିମ୍ବା 2) ଏକ ଜୀବାଣୁ ନକଲରେ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ସଂରକ୍ଷିତ nsp9 N- ଟର୍ମିନାସର ଭୂମିକା |ଆମର ତଥ୍ୟ (ଚିତ୍ର 5A) ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ପ୍ରକୃତ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ କ୍ରମକୁ ବହନ କରୁଥିବା nsp9 ର ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଫର୍ମ nsp12 ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଭାବରେ NMPized କରାଯାଇଥିଲା |ଫ୍ୟାକ୍ଟର୍ Xa (nsp9-His6; SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ସାରଣୀ S1) କିମ୍ବା Mpro- ମଧ୍ୟସ୍ଥ କ୍ଲାଭେଜ୍ (nsp7-11-His6; ଚିତ୍ର 5A ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଟ, ସାରଣୀ S1) ଦ୍ୱାରା N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଫ୍ଲାଙ୍କିଙ୍ଗ କ୍ରମକୁ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଗୁରୁତ୍ ly ପୂର୍ଣ ଭାବରେ, ଅଙ୍କିତ nsp9 ଧାରଣକାରୀ ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ nsp7-11-His6 nsp12 ର NMPylation ପ୍ରତିରୋଧ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲା, ଯାହା ଆମ ତଥ୍ୟ ସହିତ ସମାନ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ nsp9-NMP ଆଡକ୍ଟ N- ଟର୍ମିନାଲ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S5) ମାଧ୍ୟମରେ ଗଠିତ | ।NiRAN ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବିଷୟରେ ଏକ ଗଭୀର ବୁ understanding ାମଣା ପାଇବାକୁ, ତା’ପରେ ଆମେ nsp9 ର ସଂଲଗ୍ନ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେଲୁ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, ସେମାନେ ଗଠନମୂଳକ ନମନୀୟ, ସେମାନଙ୍କୁ nsp9 (26 28, 38) ର ଅବ୍ୟବହୃତ ଫର୍ମରେ ଚିହ୍ନଟ ହେବାକୁ ବାରଣ କରନ୍ତି, ସେମାନଙ୍କର ସୀମିତ ପ୍ରାକୃତିକ ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ସୂଚାଇଥାଏ ଏହା ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କ୍ରମ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାରଣରୁ ହୋଇଥାଏ (ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଗଠନ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ନୁହେଁ) nsp9 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଖଣ୍ଡର କାର୍ଯ୍ୟ |ଏହି ଅଞ୍ଚଳରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ଆଲା ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (ଚିତ୍ର 5C ଏବଂ D ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S8) ପ୍ରକାଶ କରେ ଯେ ଭିଟ୍ରୋରେ nsp9 NMPylation ପାଇଁ N3826 ଜରୁରୀ ଅଟେ, ଯେତେବେଳେ N3825A ଏବଂ E3827A ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ NMPylation ହ୍ରାସ କରିଥାଏ, M3829A ଏବଂ P3830A ପ୍ରତିସ୍ଥାପନଗୁଡ଼ିକ ନୁହେଁ | ।ଆଜ୍ଞା ହଁ nsp9 NMPylation କୁ ପ୍ରଭାବିତ କରେ |ଯଦିଓ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆସନ୍ (N3825A, N3825S) ର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ କେବଳ nsp9 NMPylation ଏବଂ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ଜୀବାଣୁ ନକଲ ଉପରେ ମଧ୍ୟମ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ (ଚିତ୍ର 5C ଏବଂ D), N- ଟର୍ମିନାଲ୍ 3825-NN ଡିପେପ୍ଟାଇଡ୍ ରୁ ଏକ ଆସ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ କ୍ରମ ବିଲୋପ | ଏହା ପ୍ରମାଣିତ ହୋଇଛି ଯେ ଏହା ଭାଇରସ୍ ପାଇଁ ଘାତକ ଅଟେ, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ N- ଟର୍ମିନାସରେ ଅନ୍ୟ ଏକ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ପୂର୍ବରୁ ଗୋଟିଏ ଆସନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟ ଆବଶ୍ୟକ, ବିଶେଷତ As ଆସନ୍, ଯଦିଓ ଏହା ଦେଖାଯାଏ ଯେ ସମାନ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ଆଂଶିକ ସହ୍ୟ କରାଯାଇପାରିବ (ଚିତ୍ର 5B, C, ଏବଂ D) |ଆମେ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେଉଛୁ ଯେ 3825-NN ଡିପେପ୍ଟାଇଡ୍, ବିଶେଷତ the କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିସର ମଧ୍ୟରେ ସଂରକ୍ଷିତ ଏବଂ ଅତ୍ୟାବଶ୍ୟକ N3826 ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S6), NiRAN ର ସକ୍ରିୟ ସାଇଟରେ nsp9 N- ଟର୍ମିନାସର ସଠିକ ବନ୍ଧନ ଏବଂ ଆଭିମୁଖ୍ୟକୁ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରେ |
ସମସ୍ତ ସବ୍ଫ୍ୟାମିଲିର ସଂରକ୍ଷିତ ଗ୍ଲୁ ପାଇଁ ଆଲା (E3827A) କୁ ବଦଳାଇବା ଭିଟ୍ରୋରେ nsp9 NMPylation ରଖେ କିନ୍ତୁ କୋଷ ସଂସ୍କୃତିରେ ଜୀବାଣୁଙ୍କ ପାଇଁ ଘାତକ (ଚିତ୍ର 5C ଏବଂ D), ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟର ଅତିରିକ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ମୁଖ୍ୟ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ (NMPylated କିମ୍ବା unmodified) | ) nsp9 N- ଟର୍ମିନାସ୍ ଏବଂ ଜୀବାଣୁ ନକଲରେ ଜଡିତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କାରଣ |Nsp9 ମ୍ୟୁଟେସନ୍ nsp9 ର ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ କିମ୍ବା କ adj ଣସି ସଂଲଗ୍ନ nsps (39) (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S9) କୁ ପ୍ରଭାବିତ କରିନଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ଦେଖାଯାଇଥିବା ଅନେକ nsp9 ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ର ସାଂଘାତିକ ଫେନୋଟାଇପ୍ C ପ୍ରୋଟୋଲାଇଟିକ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା-ଟର୍ମିନାଲ୍ pp1a ଅଞ୍ଚଳର ଡିଜେଗୁଲେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ହୋଇନଥିଲା | ।
ଉପରୋକ୍ତ ତଥ୍ୟ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ ଯେ pp1a / pp1ab ରେ nsp8 | 9 କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟର Mpro- ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଚିକିତ୍ସା ପରେ, nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସ୍ UMPylated ହୋଇପାରେ (କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ NMP ସହିତ ଆଂଶିକ ରୂପାନ୍ତରିତ) |ଏଥିସହ, nsp9 ର N- ଟର୍ମିନାସର ଉତ୍କୃଷ୍ଟ ସଂରକ୍ଷଣ (କରୋନାଭାଇରସ୍ ପରିବାରର ଏକକ ଏବଂ ଇନଭାରିଅଣ୍ଟ୍ ଆସ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି) ଏବଂ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ପ୍ରାପ୍ତ ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ ତଥ୍ୟ (ଚିତ୍ର 3E ଏବଂ 5D) ଆମକୁ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେବାକୁ ଲାଗିଲା ଯେ ବର୍ଣ୍ଣିତ nsp9 NMPylation | ଜ cor ବିକ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ନକଲ ପାଇଁ ଜରୁରୀ |ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନର କାର୍ଯ୍ୟକାରିତା ପରିଣାମ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ବାକି ରହିଲା, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ (ଅଣ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ) nsp9 (ଅଣମୋଦିତ ଫର୍ମ) RNA ବନ୍ଧନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (2628) ବିଷୟରେ |N- ଟର୍ମିନାଲ୍ NMPylation ପ୍ରୋଟିନ୍ କିମ୍ବା RNA ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ସହିତ nsp9 ର ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କିମ୍ବା ବିଭିନ୍ନ ଚାରି ସ୍ତରୀୟ ଆସେମ୍ବଲି ଗଠନ ଉପରେ ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବ ପକାଇପାରେ |ଗଠନମୂଳକ ଅଧ୍ୟୟନରେ ଏଗୁଡିକ ପାଳନ କରାଯାଇଛି ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ ନକଲ ସହିତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ଜଡିତ ଥିବା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଛି, ଯଦିଓ ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନ କ୍ଷେତ୍ରରେ (26- ââ29, 40) ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ |
ଯଦିଓ କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ଟାର୍ଗେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଅଧିକ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ହେବା ଆବଶ୍ୟକ, ଆମର ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଏ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଟାର୍ଗେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ବହୁତ ସଂକୀର୍ଣ୍ଣ |ଯଦିଓ ସମସ୍ତ ନିଡୋଭାଇରସ୍ ପରିବାରର NiRAN ଡୋମେନ୍ରେ ପ୍ରମୁଖ ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ (8, 16) ର ସଂରକ୍ଷଣ ଏହି NMPylator ର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ଦୃ strongly ଭାବରେ ସମର୍ଥନ କରେ, ଏହି ଡୋମେନ୍ ର ସଂରକ୍ଷଣ ଏବଂ ସଂରକ୍ଷଣର ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ବାନ୍ଧୁଥିବା ପକେଟ୍ ଅବଶିଷ୍ଟର ପରିଚୟ ବର୍ଣ୍ଣିତ ହୋଇ ରହିଥାଏ | , ଏବଂ Nidovirales ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟର ବିଭିନ୍ନ ପରିବାର ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ହୋଇପାରେ |ସେହିଭଳି, ଅନ୍ୟ ନଷ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଜୀବାଣୁଙ୍କର ସମ୍ପୃକ୍ତ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇ ନାହିଁ।ସେମାନେ nsp9 କିମ୍ବା ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନର ସୁଦୂର ଅର୍ଥୋଲୋଜି ହୋଇପାରନ୍ତି, କାରଣ ପାଞ୍ଚଟି ପ୍ରତିକୃତି ଡୋମେନ୍ ବାହାରେ ଥିବା କ୍ରମଗୁଡିକ ସାଧାରଣତ n ନଷ୍ଟ ହୋଇଥିବା ଭାଇରସରେ ସଂରକ୍ଷିତ ହୋଇ ରହିଥାଏ (8), Mpro ଏବଂ NiRAN ମଧ୍ୟରେ ଜିନୋମ ଆରେ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି ସେମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ nsp9 ଅବସ୍ଥିତ | କରୋନାଭାଇରସ୍ |
ଏହା ସହିତ, NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ଅତିରିକ୍ତ (ସେଲୁଲାର୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି) ଲକ୍ଷ୍ୟ ଥିବା ସମ୍ଭାବନାକୁ ଆମେ ବର୍ତ୍ତମାନ ଏଡ଼ାଇ ପାରିବୁ ନାହିଁ |ଏହି ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ, ଏହା ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ ଯେ ଏହି ଉଦୀୟମାନ ପ୍ରୋଟିନ୍ NMPylators (NMPylators) (30, 31) ରେ ଥିବା ଜୀବାଣୁ ହୋମୋଲୋଜିରେ “ମାଷ୍ଟର ରେଗୁଲେଟର” ଥିବା ପରି ମନେହୁଏ?ସେମାନଙ୍କର ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କିମ୍ବା ବିଲୋପ କରିବା ପାଇଁ NMP ବିଭିନ୍ନ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ମଡ୍ୟୁଲେଟ୍ କରିଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ cell ାରା ବିଭିନ୍ନ ଜ ological ବ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଏକ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ ଯେପରିକି ସେଲୁଲାର୍ ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଏବଂ ରେଡକ୍ସ ହୋମୋଷ୍ଟାସିସ୍ (22, 33) |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ (ଚିତ୍ର 2 ଏବଂ 4 ଏବଂ SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର S3 ଏବଂ S5), ଆମେ ପ୍ରମାଣ କରିବାକୁ ସମର୍ଥ ହେଲୁ ଯେ nsp12 UMP (NMP) ଅଂଶକୁ nsp9 ରେ ଏକକ (ସଂରକ୍ଷିତ) ସ୍ଥିତିକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିଥିବାବେଳେ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଏଥିରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ହୋଇନଥିଲା | ବ୍ୟବହୃତ ଅବସ୍ଥାରେ, ସୁ-ପରିଭାଷିତ (ଖାଲି ପରିବର୍ତ୍ତେ) ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ସମର୍ଥିତ |ଏହା ସହିତ ସ୍ଥିର, N- ଟର୍ମିନାଲ୍ nsp9 NMPylation ତୁଳନାରେ, nsp12 ର ନିଜସ୍ୱ NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ବହୁତ କମ୍, ଏହାର ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଅଧିକ ଅଟୋରାଡିଓଗ୍ରାଫି ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ, ଏବଂ nsp12 ଏକାଗ୍ରତାର 10 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |ଏହା ସହିତ, ଆମର MS ବିଶ୍ଳେଷଣ nsp12 ର NMPylation ପାଇଁ ପ୍ରମାଣ ଯୋଗାଇବାରେ ବିଫଳ ହେଲା, ଯାହା ସୂଚାଏ ଯେ NiRAN ଡୋମେନ୍ ସ୍ୱୟଂ- NMPylation ହେଉଛି ଏକ ଶ୍ରେଷ୍ଠ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ |ତଥାପି, ଏହା ମନେ ରଖିବା ଉଚିତ ଯେ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡିକ ପ୍ରାଥମିକ ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରିଛନ୍ତି ଯେ ଜୀବାଣୁ NMPylator ର ସ୍ -ୟଂ ଏମ୍ପିଲେସନ୍ ସ୍ଥିତି ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଉପରେ ସେମାନଙ୍କର NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରେ |ତେଣୁ, EAV nsp9 (16) ଏବଂ କରୋନାଭାଇରସ୍ nsp12 (ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ) ପାଇଁ ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା ସ୍ N- NMPylation କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ସମ୍ଭାବ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟକାରିତା ଅନୁସନ୍ଧାନ ପାଇଁ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ଆବଶ୍ୟକ, C- ଟର୍ମିନାଲ୍ RdRp ଡୋମେନ୍ ଫୋଲ୍ଡିଂ ଉପରେ ପ୍ରସ୍ତାବିତ ଚାପେରୋନ୍ ପରି ପ୍ରଭାବ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି ( 16)) |
ପୂର୍ବରୁ, ନିଡୋଭାଇରାଲ୍ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସମ୍ବନ୍ଧରେ ଅନେକ ଅନୁମାନକୁ ବିଚାର କରାଯାଇଥିଲା, RNA ଲିଗେଜ୍, RNA- କ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା ଗୁଆନାଲେଟ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫରେଜ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରିମିଙ୍ଗ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (16), କିନ୍ତୁ ସେଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରୁ କ available ଣସିଟି ଉପଲବ୍ଧ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ ନୁହେଁ |ନିମ୍ନଲିଖିତ ପଦବୀରେ ପ୍ରାପ୍ତ ସୂଚନା ଅତିରିକ୍ତ ଅନୁମାନ ନକରି ସମାନ ସମୟ ଅଟେ |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ମିଳିଥିବା ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରୋଟିନ-ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ RNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭରେ NiRAN ଡୋମେନ୍ ସହିତ ଜଡ଼ିତ (କିନ୍ତୁ ପ୍ରମାଣ କରିପାରୁନାହିଁ) |ଏହା ପୂର୍ବରୁ ବିଶ୍ believed ାସ କରାଯାଉଥିଲା ଯେ 5 ରେ NiRAN ଡୋମେନ୍ ର କାର୍ଯ୍ୟ ??²-RNA କ୍ୟାପିଂ କିମ୍ବା RNA ଲିଗେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଏଗୁଡିକ ଏବଂ ଅନ୍ୟ ତଥ୍ୟର ସମର୍ଥନ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ ନାହିଁ |ତେଣୁ, ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, NiRAN ର ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ସଂରକ୍ଷିତ ଆସ୍ପକୁ ଏକ ସାଧାରଣ ଆଧାର ଭାବରେ ଜଡିତ କରାଯାଏ (ସିଉଡୋମାନାସ୍ ସିରିଞ୍ଜ ସେଲୋରେ D252; HCoV-229E pp1ab ରେ D4271; SARS-CoV-2 nsp12 ରେ D208) (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଚିତ୍ର 2) )S2) (17, 22, 33), ଯେତେବେଳେ ଏଟିପି-ନିର୍ଭରଶୀଳ RNA ଲିଗେଜ୍ ଏବଂ RNA କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ରେ କାଟାଲାଇସିସ୍ କୋଭାଲାଣ୍ଟ ଏନଜାଇମ୍- (ଲାଇସିଲ୍-ଏନ) -ଏନଏମ ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଦ୍ୱାରା ପରିଚାଳିତ ହୋଇଥାଏ, ଯାହା ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇନଥିବା ଲାଇସ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇଥାଏ | 41)ଏଥିସହ, ସଂରକ୍ଷିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟ ପାଇଁ କରୋନାଭାଇରସ୍ NiRAN ର ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ କ୍ରମ-ଆଧାରିତ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ NTP ସହ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ (UTP କୁ ପସନ୍ଦ କରେ) ପାଇଁ ଆରାମଦାୟକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ କ୍ୟାପିଂ ଏନଜାଇମ୍ କିମ୍ବା RNA ଲିଗେଜ୍ ପରି କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବିରୋଧ କରେ |
ଆଜ୍ଞା ହଁ, ଯାଞ୍ଚ ପାଇଁ ଅନେକ ଅତିରିକ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟ ଆବଶ୍ୟକ ଏବଂ ଯଦି ପ୍ରମାଣିତ ହୁଏ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ uc ାରା ନିର୍ମିତ RNA ସିନ୍ଥେସିସରେ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଭୂମିକା ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କର, ଯାହା ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ ହୋଇଥିବା ଅନେକ ଆକର୍ଷଣୀୟ କିନ୍ତୁ (ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ) ରିପୋର୍ଟକୁ ସଂଯୋଗ କରିବ | ।ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ |ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଏହା ସ୍ଥିର ହୋଇଛି ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ର ନକାରାତ୍ମକ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ RNA ର ସମାପ୍ତି ଏକ ଅଲିଗୋ (U) ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ (42, 43) ରୁ ଆରମ୍ଭ ହୁଏ |ଏହି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ଧାରଣା ସହିତ ସମାନ ଅଟେ ଯେ ନକାରାତ୍ମକ-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ RNA ର ସିନ୍ଥେସିସ୍ nsp9 ର UMPylated ଫର୍ମକୁ ପଲି (A) ଲାଞ୍ଜ (ଟ୍ରିଗର) ରେ ବାନ୍ଧିବା ଦ୍ୱାରା ଆରମ୍ଭ ହୋଇଥାଏ, ଯାହା ଏହାର RNA ବନ୍ଧନ ଦ୍ୱାରା କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ / କିମ୍ବା ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରୋତ୍ସାହନ ପାଇପାରେ | ଅନ୍ୟ ଏକ RTC ପ୍ରୋଟିନ୍ |Nsp9 ଦ୍ provided ାରା ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଥିବା UMP ଅଂଶ ତା’ପରେ nsp7 / 8 / nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଅଲିଗୋରିଡିଲେସନ୍ ପାଇଁ ଏକ “ପ୍ରାଇମର୍” ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ, ଜେନୋମିକ୍ RNA ରେ 3 ?? poly-ପଲି (A) ଲାଞ୍ଜ ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା ଅନ୍ୟ ଏକ ଅଲିଗୋ (A) ଧାରଣକାରୀ କ୍ରମ | ପିକୋରନାଭାଇରସ୍ VPg ପ୍ରୋଟିନ୍ (44) ପାଇଁ ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ ଯନ୍ତ୍ରକ similar ଶଳ ପରି ଏକ ଟେମ୍ପଲେଟ୍ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ |ଯଦି ପ୍ରସ୍ତାବଟି “ଅଣ-ଆଦର୍ଶ” ଅଟେ????(ପ୍ରୋଟିନ୍-ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ) ନେଗେଟିଭ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ RNA ସିନ୍ଥେସିସ୍ ଆରମ୍ଭ, ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣଗୁଡିକ ପାଇଁ ଏକ ଲିଙ୍କ୍ ପ୍ରଦାନ କରେ, ଯାହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ କରୋନାଭାଇରସ୍ ନେଗେଟିଭ୍-ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ RNA ର UMP (UTP ପରିବର୍ତ୍ତେ) ଏହାର ଶେଷରେ (42) ଅଛି, ଯାହା ସୂଚାଇବା ପାଇଁ ବିବେଚନା କରାଯାଏ | ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ଡିସର୍ ଏକ ଅଜ୍ଞାତ ୟୁରିଡାଇନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏଣ୍ଡୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଜ୍ ଦ୍ୱାରା ଶେଷ ଫସଫୋରୀଲେଟ୍କୁ ସଫା କରେ |ଯଦି ନିଶ୍ଚିତ ହୁଏ, ଏହି ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟିକ୍ ଏସିଡ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଟିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ nsp9 ର ଅଲିଗୋମେରିକ୍ UMPylated ଫର୍ମକୁ ନାସେଣ୍ଟ୍ ନେଗେଟିଭ୍ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡର 5 ² ଶେଷରୁ ମୁକ୍ତ କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିଥାଏ |ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରିମିଙ୍ଗରେ nsp9 ର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଭୂମିକା ପୂର୍ବ ଓଲଟା ଜେନେଟିକ୍ ଅଧ୍ୟୟନ ସହିତ ମଧ୍ୟ ସମାନ, ଯାହା ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ nsp9 (ଏବଂ nsp8) କରୋନାଭାଇରସ୍ ଜିନୋମର 3 ପ୍ରାନ୍ତରେ ସଂରକ୍ଷିତ ସିସ୍-ଆକ୍ଟିଙ୍ଗ୍ RNA ଉପାଦାନ ସହିତ ସମାଲୋଚିତ ଏବଂ ବିଶେଷ ଭାବରେ ପାରସ୍ପରିକ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରିଥାଏ |45)ଏହି ରିପୋର୍ଟ ଅନୁଯାୟୀ, ଏହି ପୂର୍ବ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣଗୁଡିକ ବର୍ତ୍ତମାନ ପୁନ ined ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅନୁସନ୍ଧାନ ମାଧ୍ୟମରେ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇପାରିବ |
ସଂକ୍ଷେପରେ, ଆମର ତଥ୍ୟ N- ଟର୍ମିନାସରେ RdRp ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ ମାଲିକାନା ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଭାଇରସ୍ ଏନଜାଇମ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କଲା |କରୋନାଭାଇରସରେ, ଏହି ନୂତନ ଆବିଷ୍କୃତ NiRAN- ମଧ୍ୟସ୍ଥ UMPylator / NMPylator କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ Mn2 + ଏବଂ ସଂଲଗ୍ନ ଆସନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ ଏବଂ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପ୍ରାଥମିକ ଆମିନ ସହିତ (ସ୍ୱଳ୍ପ ଶକ୍ତି) ଫସଫୋରାମିଡେଟ୍ ବଣ୍ଡ ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ |Nsp8 | 9 କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟରେ Mpro- ମଧ୍ୟସ୍ଥ କ୍ଲାଭେଜ୍ ମାଧ୍ୟମରେ, nsp9 ଟାର୍ଗେଟ୍ NMPylation ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇପାରିବ, ଯାହାକି ପ୍ରୋଟେଜ୍ ଏବଂ NiRAN ଡୋମେନ୍ ମଧ୍ୟରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ସୂଚାଇଥାଏ, ଯାହାକି RdRp ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବିସ୍ତାର କରିଥାଏ |Nsp12 NiRAN ସକ୍ରିୟ ସାଇଟ୍ ଏବଂ nsp9 ଟାର୍ଗେଟରେ ପ୍ରମୁଖ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ସଂରକ୍ଷଣ, SARS-CoV-2 ସହିତ ଦୁଇଟି କରୋନାଭାଇରସ୍ ଠାରୁ ମିଳିଥିବା ତଥ୍ୟ ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇ ଦୃ strong ପ୍ରମାଣ ପ୍ରଦାନ କରେ ଯେ nsp9 NMPylation ହେଉଛି କରୋନାଭାଇରସ୍ କନେଷ୍ଟବଳ ବ features ଶିଷ୍ଟ୍ୟ ମଧ୍ୟ ଜୀବାଣୁ ନକଲରେ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ପଦକ୍ଷେପ |ଉପଲବ୍ଧ ତଥ୍ୟ ଆମକୁ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେବାକୁ ବାଧ୍ୟ କରେ ଯେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦ୍ ind ାରା ନିର୍ମିତ RNA ସିନ୍ଥେସିସରେ NMPylated ଫର୍ମର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭୂମିକା କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ନେଷ୍ଟେଡ୍ ଜୀବାଣୁ ପାଇଁ ଏକ ଯୁକ୍ତିଯୁକ୍ତ ଦୃଶ୍ୟ ଅଟେ, ଏବଂ NiRAN ଅନ୍ୟ ଅଜ୍ଞାତ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ମଧ୍ୟ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରିପାରେ |ଜୀବାଣୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |ହୋଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା |ଯଦି ନିଶ୍ଚିତ ହୁଏ, ଭାଇରାଲ୍ RNA ସିନ୍ଥେସିସରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରାଇମର୍ସର ଜଡିତତା ପୂର୍ବରୁ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା କରୋନାଭାଇରସ୍ ଏବଂ ପିକୋରନାଭାଇରସ୍ ପରି ସୁପର ଗ୍ରୁପ୍ (9) ମଧ୍ୟରେ Mpro / 3CLpro ଏବଂ RdRp ଡୋମେନଗୁଡିକର କ୍ରମବଦ୍ଧତା ବୃଦ୍ଧି କରିବ, ଯାହା ବର୍ତ୍ତମାନ ସ୍ଥାପିତ ପିସୋନିଭାଇରାଇଟ୍ସରେ ଏକୀଭୂତ ହୋଇଛି | 46) ବର୍ଗରେ |
ଆମର ତଥ୍ୟ ଏହା ମଧ୍ୟ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ଚିହ୍ନିତ ମ basic ଳିକ, ଚୟନକାରୀ ଏବଂ ରକ୍ଷଣଶୀଳ ଏନଜାଇମ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଆଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ drugs ଷଧ ପାଇଁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ |NiRAN ର ସକ୍ରିୟ ସାଇଟରେ ସଂରକ୍ଷିତ nsp9 N- ଟର୍ମିନାସର ବନ୍ଧନ (ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ରୂପାନ୍ତରଣ) ରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ଯ ounds ଗିକଗୁଡିକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ଏବଂ ବହୁମୁଖୀ ଆଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ drugs ଷଧରେ ବିକଶିତ ହୋଇପାରିବ, ଯାହା ବିଭିନ୍ନ (ସବ୍) ଜେନସ୍ ସଂକ୍ରମଣରୁ ପଶୁ ଏବଂ ମାନବ କରୋନାଭାଇରସ୍ ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ | , SARS-CoV-2 ଏବଂ ମଧ୍ୟ ପୂର୍ବ ଶ୍ ir ାସକ୍ରିୟା ସିଣ୍ଡ୍ରୋମ କରୋନାଭାଇରସ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ଉତ୍ପାଦିତ କରୋନାଭାଇରସ୍ ପ୍ରୋଟିନର କୋଡିଂ କ୍ରମକୁ RT-PCR ଦ୍ H ାରା HCoV-229E ସଂକ୍ରମିତ Huh-7 କିମ୍ବା SARS-CoV-2 ଦ୍ infected ାରା ସଂକ୍ରମିତ ଭେରୋ E6 ରୁ RNA ବ୍ୟବହାର କରି ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମାନକ କ୍ଲୋନିଂ ପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରି ଭର୍ତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା।pMAL-c2 (ନ୍ୟୁ ଇଂଲଣ୍ଡ ବାୟୋଲୋଜିକାଲ ଲାବୋରେଟୋରୀ) କିମ୍ବା pASK3-Ub-CHis6 (47) ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଭେକ୍ଟର (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଟେବୁଲ୍ S1 ଏବଂ S2) |PCR- ଆଧାରିତ ସାଇଟ୍-ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ମ୍ୟୁଟେଜେନେସିସ୍ (48) ଦ୍ୱାରା ଏକକ କୋଡନ୍ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ କରାଯାଇଥିଲା |MBP ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରିବାକୁ, ଇ କୋଲି TB1 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଉପଯୁକ୍ତ pMAL-c2 ପ୍ଲାସିମ୍ ନିର୍ମାଣ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ସାରଣୀ S1) ସହିତ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆମିଲୋଜ୍ ଆଫିନିଟି କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ଦ୍ pur ାରା ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଫ୍ୟାକ୍ଟର୍ Xa ସହିତ ଖଣ୍ଡ ହୋଇଯାଇଥିଲା |ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ His6- ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ନି-ଇମୋବାଇଲାଇଜଡ୍ ଧାତୁ ଆଫିନିଟି କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି (Ni-IMAC) ଦ୍ୱାରା ବର୍ଣ୍ଣିତ ହୋଇଥିଲା (49) |ଉବିକ୍ୟୁଟିନ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉତ୍ପାଦନ କରିବାକୁ, ଇ କୋଲି TB1 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଉପଯୁକ୍ତ pASK3-Ub-CHis6 ପ୍ଲାସିମ୍ କନଷ୍ଟ୍ରକସନ୍ (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ଟେବୁଲ୍ S1 ଏବଂ S2) ଏବଂ pCGI ପ୍ଲାସିମ୍ DNA ଏନକୋଡିଂ ଉବିକ୍ୟୁଟିନ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ହାଇଡ୍ରୋଲେଜ୍ 1 (Ubp1) ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲେ |ପରିବର୍ତ୍ତନ (47)ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ His6- ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା କରୋନାଭାଇରସ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା |
EAV nsp9 (16) ରେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି HCoV-229E nsp12-His6 ର ସ୍ୱୟଂ- NMPylation ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, nsp12-His6 (0.5 µM) 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM ବଫର୍, ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ ଧାରଣ କରେ | ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ NTP ଏବଂ 0.17 µM ମେଳ ହେଲା [α32-P] NTP (3000 Ci / mmol; ହାର୍ଟମ୍ୟାନ୍ ଆନାଲିଟିକ୍) 30 ° C ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ |Nsp12- ମଧ୍ୟସ୍ଥ nsp9 NMPylation ର ଅନ୍ୟ ସମସ୍ତ (ମାନକ) NMPylation ଅନୁଧ୍ୟାନରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅବସ୍ଥା ନିମ୍ନଲିଖିତ ଭାବରେ ସଜ୍ଜିତ ହୋଇଛି: 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ଉପସ୍ଥିତିରେ nsp12-His6 (0.05 µM) ଏବଂ nsp9-His6 (4 µM) | ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ସୂଚୀତ NTP, ଏବଂ 0.17 µM ମେଳ ହେଲା [α32-P] NTP |30 ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ଇନକ୍ୟୁବେସନ କରିବା ପରେ, ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ନମୁନାକୁ SDS-PAGE ନମୁନା ବଫର୍ ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରାଯାଇଥିଲା: 62.5 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍ (ହାଇଡ୍ରୋକ୍ସିମେଥାଇଲ୍) ଆମିନୋମେଟେନ୍ HCl (pH 6.8), 100 ମିମି DTT, 2.5% SDS, 10% ଗ୍ଲାଇସେରଲ୍ ଏବଂ 0.005% ବ୍ରୋମୋଫେନଲ୍ | ନୀଳପ୍ରୋଟିନକୁ 90 ° C ରେ 5 ମିନିଟ୍ ଗରମ କରି 12% SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା |ଜେଲ୍ କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ ବ୍ଲୁ ସଲ୍ୟୁସନ୍ (40% ମିଥାନୋଲ୍, 10% ଏସିଟିକ୍ ଏସିଡ୍, 0.05% କୁମାସି ବ୍ରିଲିଆଣ୍ଟ୍ ବ୍ଲୁ R-250) ସହିତ ସ୍ଥିର ଏବଂ ଦାଗଯୁକ୍ତ, 20 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଫସଫୋରସେଣ୍ଟ ଇମେଜିଙ୍ଗ ସ୍କ୍ରିନରେ ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସିଛି (NMPylation ରୁ nsp12 ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ) | କିମ୍ବା (ସର୍ବାଧିକ) 2 ଘଣ୍ଟା (nsp9 NMPylation ଆକଳନ କରିବାକୁ) |ସ୍କ୍ରିନ୍ ସ୍କାନ୍ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଟାଇଫୁନ୍ 9200 ଇମେଜର୍ (GE ହେଲ୍ଥ କେୟାର) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ସିଗ୍ନାଲ୍ ତୀବ୍ରତାକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ ImageJ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |
MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 1 µM nsp12-His6 ଏବଂ 10 µM nsp9 (ହେକ୍ସାହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ ବିନା) NMPylation ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା (SI ପରିଶିଷ୍ଠ, ସାରଣୀ S1) ଏବଂ 500 µM UTP ଏବଂ GTP ର ଏକାଗ୍ରତା ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ସେମାନଙ୍କର ଏକାଗ୍ରତା ଏବଂ ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଣ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି, ଏକ ୱାଟର ACQUITY H- କ୍ଲାସ୍ HPLC ସିଷ୍ଟମ୍ ଏକ ମାସ୍ପ୍ରେପ୍ ସ୍ତମ୍ଭ (ୱାଟର୍) ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ହୋଇ 1 ରୁ 10 µL ବଫର୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମାଧାନକୁ ଅନଲାଇନରେ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ସଜାପ୍ଟ G2Si ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (ୱାଟର) ର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋସ୍ପ୍ରେ ଆୟନ ଉତ୍ସରେ ବଫର୍ ଏ (ୱାଟର / 0.05% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍) ଏବଂ ବଫର୍ ବି (ଏସେଟୋନିଟ୍ରିଲ୍ / 0.045% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍) ର ନିମ୍ନ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ବର୍ଜିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବ uted ାଯାଇଛି | 60 ° C ଏବଂ 0.1 mL / ମିନିଟ୍ ର ପ୍ରବାହ ହାର: 2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 5% A ସହିତ ବିମୁଦ୍ରୀକରଣ, ତାପରେ 8 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ର line ଖ୍ୟ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ 95% B ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ଏବଂ ଅନ୍ୟ 4 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95% B ବଜାୟ ରଖିବା |
500 ରୁ 5000 m / z ର ପରିସର ସହିତ ସକରାତ୍ମକ ଆୟନ ଚିହ୍ନଟ ହୁଏ |ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ମାସ ଡ୍ରାଇଫ୍ ସଂଶୋଧନ ପାଇଁ ଗ୍ଲୁ-ଫାଇବ୍ରିନୋପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବି ପ୍ରତି 45 ସେକେଣ୍ଡରେ ମାପ କରାଯାଏ |ବେସ୍ ଲାଇନ୍ କାଟିବା ଏବଂ ସଫାସୁତୁରା କରିବା ପରେ ହାରାହାରି ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମକୁ ଡିକନଭୋଲଭ୍ କରିବା ପାଇଁ MaxEnt1 ଏକ୍ସଟେନ୍ସନ୍ ସହିତ MassLynx ଉପକରଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
UMPylated HCoV-229E nsp9 ସିକ୍ୱେନ୍ସିଂ-ଗ୍ରେଡ୍ ରୂପାନ୍ତରିତ ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ (ସର୍ଭା) ଯୋଗ କରି ହଜମ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ରାତାରାତି 37 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡ଼ିକୁ ନିଷ୍କାସନ ଏବଂ ଏକାଗ୍ର କରିବା ପାଇଁ ଏକ କ୍ରୋମାବଣ୍ଡ C18WP ସ୍ପିନ୍ ସ୍ତମ୍ଭ (ଅଂଶ ସଂଖ୍ୟା 730522; ମାକେରି-ନାଗେଲ୍) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଶେଷରେ, ପେପ୍ଟାଇଡ୍ 25 µL ପାଣିରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ହେଲା, ଯେଉଁଥିରେ 5% ଆସେଟୋନିଟ୍ରିଲ୍ ଏବଂ 0.1% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ ରହିଥିଲା |
ଏକ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଭେଲୋସ୍ ପ୍ରୋ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର (ଥର୍ମୋ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ନମୁନାଗୁଡିକ MS ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଅନ୍ତିମ nanoâ HPLC ସିଷ୍ଟମ୍ (Dionex), ଏକ କଷ୍ଟମ୍ ଏଣ୍ଡ-ମାଉଣ୍ଟେଡ୍ 50 ସେ.ମି.75 μm C18 RP ସ୍ତମ୍ଭ 2.4 μm ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡି ସହିତ ପ୍ୟାକ୍ ହୋଇଛି (ଡ।6 µL ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ ହଜମ ସମାଧାନକୁ 300 µm ଭିତର ବ୍ୟାସ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଅନ୍ତୁ ??1 ସେମି C18 PepMap ପ୍ରି-ଏକାଗ୍ରତା ସ୍ତମ୍ଭ (ଥର୍ମୋ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) |ଜଳ / 0.05% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ ଦ୍ରବଣକାରୀ ଭାବରେ ବ୍ୟବହାର କରି, ନମୁନାଟି ସ୍ୱୟଂଚାଳିତ ଭାବରେ 6 µL / ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ଫସି ରହିଥିଲା |
ନିମ୍ନୋକ୍ତ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ ଜଳ / 0.05% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ (ଦ୍ରବଣକାରୀ A) ଏବଂ 80% ଆସେଟୋନିଟ୍ରିଲ୍ / 0.045% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ (ଦ୍ରବଣକାରୀ ବି) 300 nL / ମିନିଟ୍ ପ୍ରବାହ ହାରରେ ଟ୍ରାଇପଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ପୃଥକତା ହାସଲ କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା: 4% B ପାଇଁ 5 ମିନିଟ୍, ତାପରେ 30 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ 45% B ରୁ ଏକ ର ar ଖ୍ୟ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍, ଏବଂ 5 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ର ar ଖ୍ୟ 95% ଦ୍ରବଣକାରୀ B କୁ ବୃଦ୍ଧି ହୁଏ |କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫିକ୍ ସ୍ତମ୍ଭକୁ ଏକ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ନାନୋ-ଏମିଟର (ପ୍ରକ୍ସିନ୍) ସହିତ ସଂଯୋଗ କରନ୍ତୁ, ଏବଂ 2300 V. ର ଏକ ସମ୍ଭାବନାକୁ ବ୍ୟବହାର କରି ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟରର ଉତ୍ତପ୍ତ କ୍ୟାପିଲାରୀ ସହିତ ସ୍ପ୍ରେ ସ୍ପ୍ରେ କରନ୍ତୁ | ଅତିକମରେ ତିନୋଟି ଡାଟା MS / MS ସ୍କାନ୍ ସହିତ, ଗତିଶୀଳ ଭାବରେ 30 ସେକେଣ୍ଡ ପାଇଁ ବାଦ ଦିଆଯାଇଛି, ର line ଖ୍ୟ ଆୟନ ଟ୍ରାପ୍ ଧକ୍କା ଦ୍ uc ାରା ପ୍ରବର୍ତ୍ତିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା କିମ୍ବା ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଚିହ୍ନଟ ସହିତ ଅଧିକ ଶକ୍ତି ଧକ୍କା ବିଚ୍ଛେଦ ବ୍ୟବହାର କରି ରେଜୋଲୁସନ 7,500 ଅଟେ |
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ଅଗଷ୍ଟ -03-2021 |